论文总字数：16037字
摘 要
构建一种新的纳米电致化学发光（ECL）免疫传感体系来定量检测肿瘤蛋白p53。方法 经静电纺丝制备羧基化多壁碳纳米管（MWCNTs）掺杂的壳聚糖（CTS）复合纳米纤维（CTS-MWCNTs），在其表面电聚合硫堇（TH），获得功能复合纳米纤维（CTS-MWCNTs-PTH）修饰电极。CTS-MWCNTs-PTH修饰电极固载捕获抗体Ab1形成免疫活性界面（Ab1/GC）。Ab1/GC界面先后捕获p53蛋白（AGp53）、Ru(bpy)32 掺杂SiO2核壳型纳米粒子（Ru(bpy)32 -SiO2NPs）标记的Ab2抗体（Ru(bpy)32 -SiO2@Ab2），构建功能复合纳米纤维电致化学发光双抗夹心三明治免疫新体系（Ab1-AGp53-Ru(bpy)32 -SiO2@Ab2/GC），应用ECL检测Ru(bpy)32 的信号，用以定量检测肿瘤蛋白p53。结果 在最优条件下，p53蛋白的线性范围为1×10-9 ~ 1×10-6 mg/mL，最低检测限为5×10-10 mg/mL。结论 在分子层面上，灵敏、准确地测定靶分子肿瘤蛋白p53。为肿瘤相关蛋白表达的分析检测提供一种新思路。关键词: 静电纺丝，功能复合纳米纤维，电致化学发光，肿瘤蛋白p53，免疫传感器
The nano electrochemical biosensor for sensitive detection of
tumor suppressor protein p53
Abstract: Objective In order to establish a new electrogenerated chemiluminescene immunosensor for quantification of the p53 protein. Methods A carboxylated multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) doped chitosan(CTS) composite fibers (CTS-MWCNTs) was prepared using electrospinning and coated on a GC electrode, which served as the nanosized backbone for thionine (TH) electropolymerization. The functional composite nanofibers (MWNTs-CTS-PTH) used as supporting scaffolds to immobilize capture antibody (Ab1) and then to form an Ab1/GC immune activity sensing interface. Then, based on sandwhich immumoassay, the resulting new functional composite nanofibers ECL immunocomplex system (Ab1-AGp53-Ru(bpy)32 -SiO2@Ab2/GC) is formed by the sensing interface, capture p53(AGp53) and Ru(bpy)32 -SiO2-labled detection antibody (Ru(bpy)32 -SiO2@Ab2). Electrogenerated chemiluminescene (ECL) was performed to obtain the signal of the Ru(bpy)32 for quantification of the p53 protein . Results Under the optimal conditions, the ECL was strongly linearly related to p53 protein concentration in the range of 1×10-9 mg/mL to 1×10-6 mg/mL and the detection limit was down to 5×10-10 mg/mL. Conclusion Thus, a more sensitive and more accurate ECL immunosensor was establish for quantification of the p53 protein. This easily fabricated immunosensor provides a new promising tool for analysis of p53 and other protein, early diagnosis of cancer and monitoring of patient therapy.
Key words: electrospinning, functional composite nanofibers, electrogenerated chemiluminescene , p53 protein, immunosensor
引言
P53基因是一种重要的抑癌基因，若其突变或表达过度时，失去了调控细胞增殖、分化或DNA修复的功能，转变为癌基因[1-5]。因此p53基因是目前所发现的与肿瘤发生、发展相关性最高的基因。P53蛋白是p53基因的表达产物，血液p53 蛋白水平与多种肿瘤呈正相关，对肺癌、胃癌、原发性肝癌、乳腺癌等恶性肿瘤的早期检测、治疗效果评估、预后判断有很高的特异性[6-8]。由此，p53蛋白检测成为了临床肿瘤标志物检测、肿瘤相关流行病学研究的首选指标。在临床恶性肿瘤诊断治疗，肿瘤流行病现场筛查、普查，职业致癌因素、环境致癌因素的健康危害监测等方面有巨大的实用价值。
一直以来检测p53蛋白的最常用的方法为酶联免疫分析法（ELISA）[9]。ELISA是在RIA基础上，根据酶免疫测定的原理发展起来的目前应用最久、较为有效的技术，虽然特异性、稳定性较好，但操作步骤繁杂，测定时间较长，且灵敏度很低，不适于痕量样品测定，仍需进行信号扩增等改进[10]。放射免疫分析法（RIA）、免疫组织化学法（IHC）、组织微阵列技术（TMA），免疫－聚合酶链扩增技术(IPCR)，流式细胞技术（FCM）等[11]也不同程度地被使用，但都存在一定程度的缺陷。比如RIA的放射性污染；IHC免疫组织化学法的染色差异，测量耗时，重复性差，且不能定量，只能检测到突变型p53蛋白等问题[12-14]；以及其他一些新方法的成本过高、试剂昂贵等问题。近年来基于纳米材料的电化学免疫传感器检测正慢慢发展起来，因其诸多优势，逐渐替代ELISA。
电化学发光（ECL），又称电致化学发光，通过电激发电化学发光活性物质，产生光辐射，利用光电倍增管捕获后，测量其发光强度，进行痕量的检测。该方法同时具备化学发光的高灵敏度、低检测限、宽线性范围以及电化学分析法的选择性高、重现性好、稳定的优点[15]。电化学发光免疫传感检测法就是运用了电致化学发光技术的免疫传感器，通过识别、传感、信号转换元件、建立免疫复合物和ECL信号的定量联系，将免疫反应引起的化学变化信号转变为可检测的电化学发光信号，实现了目标物的高灵敏度、高选择性检测，近年来广泛用于临床生物分子检测、环境监测、食品分析等领域[16]。该方法通过提高检测灵敏度，极有希望解决血液中组分复杂，p53蛋白含量低而难以检测的问题。
纳米材料是指在三维尺度中，至少有一维处于纳米尺寸量级(1-100 nm)的材料，由于独特的尺寸使其产生了很多不同于传统材料的独特性能。纳米材料具有比表面积较大、对生物大分子的富集吸附能力强、生物相容性较好以及表面反应活性高的特点，使其在电化学免疫传感器的研究中得到了广泛应用[17-18]。纳米材料可用于修饰传感界面，修饰电极，加速电子转移而增强信号响应，还可标记生物分子，增加固定量，放大检测信号，增强检测灵敏度[19]。随着医药卫生领域对生物分子检测灵敏度的要求越来越高，为了满足血液极低浓度的p53蛋白检测，需要将纳米材料与其他技术相结合，开发用于实现高灵敏度的电化学发光免疫传感器。本论文用到了纳米纤维和纳米颗粒，通过静电纺丝/电聚合制备功能复合纳米纤维修饰电极，改善了导电性能，电极的比表面积也得到了放大，有效提高抗体固载量；经核壳型纳米颗粒来包载电致化学发光物质，用于标记抗体，实现信号显著增强。
本论文从免疫分子界面固载材料和检测抗体标记物为主要着手点。一方面通过静电纺丝技术将模板高分子壳聚糖与导电纳米材料羧基化碳纳米管结合而制备出导电复合纳米纤维，再经电聚合硫堇的方法获得比表面积大、电子传递快、具有良好生物相容性的功能复合纳米纤维，作为免疫分子固载材料修饰电极，构建传感界面。与此同时，经反相微乳液法制备Ru(bpy)32 掺杂SiO2核壳型纳米粒子（Ru(bpy)32 -SiO2NPs），用来标记检测抗体，显著放大检测信号，增强灵敏度。再协同双位点夹心法，构筑p53蛋白的电致化学发光免疫检测新系统。在分子层面上，灵敏、准确地测定靶分子肿瘤蛋白p53，为肿瘤相关蛋白表达的分析检测提供一种新思路。
1 实验内容
1.1仪器与试剂
CHI660D电化学工作站（上海辰华，中国），MPI-E电致化学发光检测仪（西安瑞迈，中国）。JEOL-JEM-1100F 透射电子显微镜(日本JEOL公司)， IX71-F22FL/PH荧光倒置显微镜（日本奥林巴斯）。
铂丝的对电极、Ag/AgCl参比电极和玻璃碳工作电极构成三电极系统。
自行设计了一套可控静电纺丝系统，该系统由液体供给装置、静电高压发生装置、喷射装置、收集装置等4个部分构成。系统中的喷射装置设计有单喷射头、复合喷射头，可实现同时或间替喷射2种相同或不同液体，分为滚轴接收、平板（可以替换为电极）接收2种收集装置的设计，适用于不同性能的纺丝溶液来制备不同结构的纳米纤维。
羧基化的多壁碳纳米管(COOH-MWCNTs)购自深圳纳米港高科技有限公司，管长1 ~ 10 m，直径40 ~ 60 nm。壳聚糖（CTS）购自浙江金壳科技有限公司。 Ru(bpy)32 、硫堇单体、N-(2-氨基乙基)-1,2-乙二胺(DETA)、人血清白蛋白(HAS)、免疫球蛋白(IgE)购自美国Sigma公司。检测抗体Ab1(Anti-TP53 Rabbit Polyclonal Antibody)、AGp53(TP53 Antigen)、检测抗体Ab2 (AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H L)、BSA(Bovine Serum Albumin)、PBS-Antibody Diluent (10x)均购自上海生工生物有限公司。实验中使用溶液：1mmol/LK3Fe(CN)6溶液(0.1mol/L KCl)，10 mmol/L PBS (pH 7.2)。0.1mol/L PBS (pH 6.0)，0.1mol/L盐酸溶液，1.0×10-4mol/L 硫堇单体溶液，5.0×10-3 mol/L K4Fe(CN)6 (1.0 mol/L KCl)，1.0 mmol/LTPrA，1%的牛血清蛋白（BSA），1.0mmol/LHAc溶液。溶液配置全用二次去离子水，其它试剂均为分析纯。
1.2实验方法
本论文应用功能复合纳米纤维生物传感平台，对p53蛋白进行直接检测，检测过程见图1。首先，利用静电纺丝技术，将羧基化多壁碳纳米管（MWCNTs）掺杂的壳聚糖（CTS）复合纳米纤维（CTS-MWCNTs）收集在裸GC电极表面，获得CTS-MWCNTs/GC电极。CTS-MWCNTs/GC电极经电聚合硫堇（TH），获得CTS-MWCNTs-PTH/GC电极。CTS-MWCNTs-PTH功能复合纳米纤维作为新型免疫分子固定化载体，经静电吸附捕获抗体Ab1，构建功能复合纳米纤维生物传感界面，即Ab1/GC电极，再与p53蛋白培育形成Ab1-AGp53/GC电极。通过反相微乳液法合成Ru(bpy)32 掺杂SiO2核壳型纳米粒子（Ru(bpy)32 -SiO2NPs），用NH2进行表面修饰，所制得的NH2基修饰的Ru(bpy)32 -SiO2NPs温育标记检测抗体Ab2，再与前面形成的Ab1-AGp53/GC电极共同温育，形成双抗体夹心ECL免疫分析系统，记作Ab1-AGp53-Ru(bpy)32 -SiO2@Ab2/GC电极。采用三电极系统，在电化学测量池中，对Ab1-AGp53-Ru(bpy)32 -SiO2@Ab2/GC电极进行ECL扫描。根据Ru(bpy)32 的ECL信号，用以定量检测p53蛋白。电极具体构建过程如下详述。
图1 功能复合纳米纤维生物传感平台检测AGp53的过程示意图
1.2.1 CTS-MWCNTs/GC电极制备
纺丝溶液配制：
将壳聚糖（CTS）与2mg碳管（MWCNTs）溶解于混合溶剂（乙酸：水=0.2:9.8）10 mL中，最后将混合物在室温下连续搅拌12 h，即制备成所要求的纺丝液。
静电纺丝条件设置：
在静电纺丝时，正极置于聚合物溶液中，负极连接在收集板上（收集板上固定电极）。注射器末端连接针头，将制得的静电纺丝溶液置入20 mL的医用注射器中，由高压静电发生器产生的高压静电直接施加在针头上，供液采用微量注射泵，电极表面即可直接收集静电纺丝纳米纤维。
最优的条件进行实验：7号针头，电压：17 ~21 V，注射器流速：0.2 mL/h，针头与电极距离18~20 cm，纺丝时间一般为3~5 min，实验环境温度为25 ℃，湿度控制在40 %。
CTS-MWCNTs/GC电极制备：
在麂皮上将玻碳电极（GC）打磨抛光（Al2O3），先后分别用二次去离子水、乙醇超声洗涤干净。先浸入0.5 mol/L NaOH，在 -0.2 ~ 0.6 V的范围内进行循环扫描1圈（扫速0.05 V/s），再浸入0.5 mol/L H2SO4溶液中，在 -0.2 ~ 1.7 V (vs. Ag/AgCl) 的范围内进行循环扫描10 圈（扫速0.1 V/s），取出用二次去离子水淋洗干净。
将上述洗净的玻碳电极（GC）在麂皮上打磨抛光，经二次去离子水洗涤干净。浸入1mmol/L K3Fe(CN)6溶液中，用电化学工作站进行扫描，设置参数为-0.2 ~ 0.6 V (vs. Ag/AgCl，扫速0.07V/s)的范围，设定所用技术为CV法，多次扫描得到电位差较小的稳定的CV图谱。
将上述GC电极直接用作静电纺丝的收集器，将纺丝液直接电纺在电极的表面来进行电极的修饰。这种修饰了CTS-MWCNTs的电极称为CTS-MWCNTs/GC电极。
1.2.2 CTS-MWCNTs-PTH/GC电极制备
将CTS-MWCNTs/ GC电极浸于6 mL含1.0×10-4mol/L 硫堇单体的0.1mol/L PBS聚合液（pH6.0）中，以 1.5 V电压10min施加于电极，进行阳极化处理，用循环伏安法进行扫描，扫描电位：−0.40～ 0.17 V，扫速：45 mV/s，扫描圈数：8圈。最后将电极用10 mmol/L PBS (pH 7.2)溶液洗去吸附在电极上的硫堇单体。聚合反应完成后，可以明显发现电极表面被一层蓝紫色的膜所修饰。把这种修饰了PTH的电极称为CTS-MWCNTs-PTH/GC电极。
1.2.3 Ab1/GC电极的制备（捕获抗体Ab1的固定）
将CTS-MWCNTs-PTH/GC电极与10 mM PBS (pH 7.2)含0.1 M EDAC 与Ab1于37 ℃温育50 min。电极经10 mmol/L PBS (pH 7.2)溶液清洗，洗净电极表面非特异性吸附的Ab1，把该电极称为Ab1 /GC电极。Ab1/GC电极浸入1%的牛血清蛋白（BSA）中，于室温条件下放置30 min左右，以封被电极表面未被捕获抗体覆盖的活性位点，4℃ 放置备用（即获得捕获抗体修饰电极）。对捕获抗体浓度、pH、培育时间等条件参数进行优化。
1.2.4 Ab1-AGp53/GC电极的制备（AGp53的固定）
Ab1/GC电极与p53蛋白于37 ℃温育50 min。电极经10 mmol/L PBS (pH 7.2)溶液清洗，此电极记作Ab1-AGp53/GC电极。对时间、温育的温度、清洗的次数等相关条件参数进行优化。
1.2.5 Ab1-AGp53-Ru(bpy)32 -SiO2@Ab2/GC电极的制备（检测抗体Ru(bpy)32 -SiO2@Ab2的固定）
Ru(bpy)32 -SiO2NPs的合成：
参照文献[20,21,22]，根据反相微乳液法的原理，向三联吡啶釕水溶液中添加有机溶剂和表面活性剂，使三联吡啶釕、有机溶剂、表面活性剂共同混合搅拌反应一段时间，形成油包水（Ru(bpy)32 水溶液为水相，Ru(bpy)32 包裹在内）体系。继续加入氨水和TEOS（正硅酸乙酯），注意应保证冰浴环境，实验过程中不断添加冰块保持低温，以较大的搅拌速度8000r/s搅拌较长时间确保其充分反应，使纳米颗粒分散均匀[23]。之后，向该溶液中加入丙酮，以适当的搅拌速度使之搅拌均匀，使Ru(bpy)32 -SiO2NPs沉淀从溶液中分离出来。搅拌完成后，再马上进行离心，选择较高速度约8分钟，可见底部出现了橙黄色的沉淀（Ru(bpy)32 -SiO2NPs）。弃去上清液后，分别以无水乙醇、二次去离子洗涤沉淀（Ru(bpy)32 -SiO2NPs）数次，充分洗净Ru(bpy)32 -SiO2NPs纳米颗粒表面残留的一些离子和溶剂。2℃环境下，将制备好的纳米颗粒分散在pH7.2的PBS溶液中备用。
Ru(bpy)32 -SiO2NPs的表面修饰：
参照文献[21,22,24]， 修饰Ru(bpy)32 -SiO2纳米颗粒的表面。取上一步制备得到低温备用的Ru(bpy)32 -SiO2NPs溶液，经离心后，弃上清，取沉淀，用少量的去离子水分散均匀后，注意现用现配的HAc溶液和二乙烯三胺DETA（2 %）的混合溶液，将分散后的纳米颗粒溶液加入混合溶液中，置于室温环境中，用中等速度在磁力搅拌机上搅拌反应半小时，使Ru(bpy)32 -SiO2纳米颗粒表面成功结合氨基，即完成了修饰。之后，用较高转速离心8分钟，弃上清，取沉淀，为保证除去沉淀表面残留的二乙烯三胺等试剂，需洗涤多次。沉淀用磷酸缓冲液(PH7.2)搅拌均匀，用于标记检测抗体Ab2。
检测抗体Ab2的标记：
取上述NH2基修饰后的Ru(bpy)32 -SiO2NPs与含0.1 M EDAC 和检测抗体Ab2的PBS于37 ℃温育50 min。电极经10 mmol/L PBS (pH 7.2)溶液清洗，除去电极表面非特异性吸附的Ab2，即获得Ru(bpy)32 -SiO2@Ab2。
Ab1-AGp53/GC电极与Ru(bpy)32 -SiO2@Ab2于37 ℃温育50 min。电极经10 mM PBS (pH 7.2)溶液清洗，获得双抗体夹心免疫分析系统。此电极记作Ab1-AGp53-Ru(bpy)32 -SiO2@Ab2/GC电极。对温育的时间、温度、沉淀清洗的次数等相关条件参数进行优化。
1.2.6电致化学发光（ECL）检测
采用三电极系统，在10 mL的电化学测量池中，以Ab1-AGp53-Ru(bpy)32 -SiO2@Ab2/GC电极为工作电极，设置参数：电压范围为 0.3 ~ 1.7V，设置速度为101 mV/s扫速，选择技术为CV循环伏安法，扫描后分别得到的循环伏安扫描图谱(CV)和ECL谱图。
1.3表征实验
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