亚硝胺对食管细胞毒性的初步研究

论文总字数：8940字

摘 要

探讨人正常食管细胞Het-1A和食管癌细胞EC109暴露于低浓度MNNG的活性变化。方法 用不同浓度的MNNG（0、5、50、500pmol/l，5、50、500nmol/l，5μmol/l）分别对人正常食管上皮细胞Het-1A和食管癌细胞EC109染毒，染毒时间为12、24、48、72小时。采用MTT比色法检测细胞的活性。结果 在相同暴露时间下，除5pmol/l外各剂量组细胞生长抑制率随剂量的增加而增加，差异具有统计学意义；在相同染毒剂量下，各组细胞生长抑制率随染毒时间的增加而增加；相同暴露时间和染毒剂量下， EC109的细胞生长抑制率大于Het-1A细胞。结论 低浓度MNNG暴露可抑制人正常食管上皮细胞Het-1A和食管癌细胞EC109的生长，肿瘤细胞对外源化学物质的作用更加敏感。

关键词：MNNG，Het-1A细胞株，EC109细胞株，细胞生长抑制率

The toxicity of esophageal cells exposed to low concentrations of MNNG

Abstract: Objective To investigate the changes of human normal esophageal cells Het-1A and esophageal cancer cell EC109 exposed to low concentration of MNNG. Methods Human normal esophageal epithelial cells Het-1A and esophageal cancer cells EC109 were exposed to different concentrations of MNNG (0, 5, 50, 500pmol/l, 5, 50, 500nmol/l, 5μmol/l). The cell viability was measured by MTT assay at 24, 48 and 72 hours. Results In the same exposure time, the cell growth inhibition rate increased with the increase of dose except 5pmol/l groups, the difference was statistically significant. At the same dose, the cell growth inhibition rate of each group was significantly higher than that in the control group. The cell growth inhibition rate of EC109 was greater than that of Het-1A cells at the same exposure time and exposure dose. Conclusion Low concentration of MNNG can inhibit the growth of human normal esophageal epithelial cells Het-1A and esophageal cancer cell EC109, and the effect of tumor cells on exogenous chemicals is more sensitive.

Key words: MNNG; Het-1A cell line; EC109 cell line; Cell growth inhibition rate

1 绪论

1.1 引言

食管癌是一种很常见的消化道恶性肿瘤，近年来我国食管癌发病率和死亡率均居全球第一位。全球肿瘤流行病统计数据（GLOBOCAN 2015）显示，2015年我国食管癌的新发病例数为47.8万，死亡病例数为37.5万。食管癌占据我国恶性肿瘤死因的第四位^[1]。已有的研究表明，食管癌是一种多种因素作用、多位基因参与、多个阶段发展的复杂性的疾病，其中，环境因素在其发生发展中占据主导地位^[2]。有资料显示，亚硝胺类物质暴露与食管癌发生密切相关。

亚硝胺类化合物是一大类强致癌物质。已被发现的亚硝胺类化合物有三百多种，超过百分之九十已被确认对动物具有“三致”作用^[3]。N-亚硝胺类化合物是一类广泛存在于自然环境中的致癌物，其与多种器官的恶性肿瘤的发生及发展存在着紧密的联系。1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍（MNNG）属N-亚硝胺类物质，其作为亚硝胺的模式替代物，常用于有关环境中的亚硝胺类物质诱发肿瘤的研究^[4]。动物实验证明，甲基硝基亚硝基胍可引起多种动物的食管癌^[5]；流行病学的相关研究表明，N-亚硝胺类物质在人群中的暴露水平和食管癌的发病率、死亡率相一致，呈明显的正相关 ^[6]。

近年来，由于生活及工业废水的大量排放、农业氮肥农药的过度使用，使得地表水体中的含氮化合物急剧增加^[7]。含氮的化合物可以通过食物、饮用水等途径进入人体内，进而在人体内合成N-亚硝基化合物，N-亚硝基化合物可引起体内原癌基因和抑癌基因的改变从而引起食管、胃和肝等器官的癌变。而含较高含量含氮化合物的水源水经过集中式供水氯化消毒处理后即可产生亚硝胺类消毒副产物，氯化消毒是目前集中式供水普遍采用的消毒方式，因而人群通过饮水途径可长期、持续地暴露于亚硝胺类消毒副产物造成潜在的健康危险^[8]。

1.2 本文的研究目的

基于以上认识，本研究利用MTT比色法检测MNNG暴露对人正常食管上皮Het-1A细胞和食管癌EC109细胞活性的影响，探讨Het-1A和EC109暴露于低浓度MNNG的活性差异，为进一步研究亚硝胺对食管癌的作用机制提供毒理学依据。

2 材料与方法

2.1材料与试剂

人正常食管上皮细胞株Het-1A（来源于环境医学工程教育部重点实验室），食管鳞癌细胞株EC109（来源于环境医学工程教育部重点实验室），RPMI 1640培养基（BIOFIL公司，中国），S711-001S胎牛血清（LONSERA公司，中国），胰蛋白酶（LONSERA公司，中国），MNNG（BIOMART公司，中国），二甲基亚砜（SIGMA公司，美国），MTT（SIGMA公司，美国），Series 8000直热式CO₂恒温培育箱（Thermo公司，美国），Epoch全波长酶标仪（BioTek公司，美国），CK40-F200倒置显微镜（OLYMPUS公司，日本）。

2.2 方法

2.2.1 细胞培养

包含两种细胞的复苏、传代、换液、冻存和计数等。

2.2.1.1 细胞复苏（快速融化法）

取实验室冻存的Het-1A和EC109细胞，迅速放入37℃水浴锅中快速晃动，使其完全融化；将冻存管中细胞液吸入15ml离心管中，加入3ml 1640完全培养基，于800rpm转速下离心5min，弃去上清，加入4ml完全培养基吹匀，接种于25cm²细胞培养瓶中，置培养箱中培养；细胞密度达70%时传代。

2.2.1.2 细胞传代

用一次性吸管吸弃旧培养基，PBS缓冲液清洗3遍细胞后，加入1ml 0.25%胰酶，放入37℃温箱内静置，密切观察细胞形态，待细胞缩小至圆形并从瓶壁脱落，加入2ml完全培养基终止消化；将培养瓶内细胞液转入15ml无菌离心管中，800rpm离心5min，离心结束后，弃上清，加入2ml完全培养基轻轻吹打重悬细胞，分装入2个新培养瓶中，加培养基至4ml/瓶，标记好细胞名称、代数、传代日期、传代人，放入CO₂培养箱中静置培养。

2.2.1.3 细胞换液

用一次性吸管吸弃旧培养基，PBS缓冲液清洗细胞3遍后，加入4ml新鲜的完全培养基。

2.2.2 细胞分组及染毒

待细胞长至对数生长期时计数，浓度调整至适当的大小，每孔200微升含5000个细胞，接种到96孔板上，将其分为9组：空白组、阴性对照组、MNNG染毒组（染毒剂量为5、50、500pmol/l，5、50、500nmol/l，5μmol/l），每组设立5个平行样，边缘加PBS防止边缘效应。染毒组种板4h后弃上清，分别加入不同浓度MNNG进行染毒。

2.2.3 细胞增殖测定

染毒12、24、48、72小时后分别采用四唑盐（MTT）比色法测定两种细胞各时间段的生长抑制率。将培养基和染毒液吸掉，每孔加入150μl纯1640培养基和20μlMTT，至恒温箱孵育4h后取出弃溶液，加入150μlDMSO振荡溶解结晶后用酶标仪于490nm波长下测定各孔的吸光度值（OD）。按照公式：细胞的生长抑制率（%）=（对照组的吸光度值-实验组的吸光度值）/对照组的吸光度值×100% 计算染毒后各孔细胞的抑制率。

2.2.4 统计学处理

应用SPSS 22.0软件对实验所得数据进行统计学分析。所有实验数据均重复三次，以均数加减标准差表示，各组间的比较采用one-way ANOVA，方差齐性资料两两比较采用SNK法。检验水准设为0.05。

3 结果

3.1 MNNG对Het-1A细胞活性的影响

Het-1A细胞暴露于不同浓度MNNG的细胞生长抑制率见表1、图1。

表1 Het-1A细胞暴露于不同浓度MNNG的细胞生长抑制率（n=3，，%）

MNNG浓度	12h	24h	48h	72h
0pmol/l	0	0	0	0
5pmol/l	1.45±1.32	4.10±0.06	7.62±0.24 b1c1	7.15±0.45 a1b1
50pmol/l	3.53±1.12a1	5.03±0.78 a1	10.19±1.01 a1b1c1	8.03±0.60 a1b1c1d1
500pmol/l	4.82±1.44 a1	7.19±0.41 a1b1	11.97±1.47 a1b1c1	8.75±0.37 a1b1d1
5nmol/l	6.25±2.00 a1	9. 23±0.17 a1b1	14.14±1.50 a1b1c1	9.84±1.60 a1b1d1
50nmol/l	7.11±1.69 a1	10.35±0.15 a1b1	16.52±1.85 a1b1c1	10.54±2.33b1d1
500nmol/l	9.36±2.29 a1	11.78±1.43 a1	17.97±1.24 a1b1c1	12.33±3.16d1
5μmol/l	10.07±1.83 a1	14.13±0.73 a1	20.48±0.79 a1b1c1	15.95±3.93d1

注：^a1与阴性对照组（0pmol/l）相比，Plt;0.05；^b1与12h组相比，Plt;0.05；^c1与24h组相比，Plt;0.05；^d1与48h组相比，Plt;0.05。

相同染毒时间时，50pmol/l - 50nmol/l之间的各剂量组与对照组相比差异具有统计学意义（Plt;0.05）；50nmol/l - 5μmol/l之间的各染毒剂量组除72h组外与对照组相比差异具有统计学意义（Plt;0.05）。

相同染毒剂量时，500pmol/l - 50nmol/l 之间的各剂量组与染毒12h同染毒剂量组相比差异具有统计学意义（Plt;0.05）；染毒48h的各剂量组与染毒24h同染毒剂量组相比差异具有统计学意义（Plt;0.05）；染毒72h的50pmol/l - 5μmol/l之间的各剂量组与染毒48h同染毒剂量组相比差异具有统计学意义（Plt;0.05）。

各剂量组的细胞生长抑制率随着浓度的增加呈现递增趋势，且染毒浓度越高，趋势越明显。

3.2 MNNG对EC109细胞活性的影响

EC109细胞暴露于不同浓度MNNG的细胞生长抑制率见表2、图2。

表2 EC109细胞暴露于不同浓度MNNG的细胞生长抑制率（n=3，，%）

MNNG浓度	12h	24h	48h	72h
0pmol/l	0	0	0	0
5pmol/l	3.84±0.75	4.38±3.09	19.05±4.4b2c2	25.09±12.83 a2b2c2
50pmol/l	6.50±1.04 a2	8.58±6.44 a2	24.57±2.17 a2b2c2	30.22±10.99 a2b2c2
500pmol/l	8.94±8.96 a2	12.53±3.91 a2	29.73±2.00 a2b2c2	31.94±10.42 a2b2c2
5nmol/l	10.83±2.00 a2	17.14±2.83a2	33.18±1.58 a2b2c2	33.98±10.75 a2b2c2
50nmol/l	12.40±4.46 a2	19.60±3.94 a2	34.86±1.55 a2b2c2	37.86±9.17 a2b2c2
500nmol/l	14.37±2.11 a2	22.85±4.25 a2	37.78±3.75 a2b2c2	40.27±8.76 a2
5μmol/l	16.53±1.10 a2	25.32±3.62 a2	43.09±9.37a2b2c2	45.79±10.77 a2b2c2

注：^a2与阴性对照组（0pmol/l）相比，Plt;0.05；^b2与12h组相比，Plt;0.05；^c2与24h组相比，Plt;0.05；^d2与48h组相比，Plt;0.05。

相同染毒时间时，各时间组的50pmol/l - 5μmol/l之间的各MNNG染毒剂量组与对照组相比差异具有统计学意义（Plt;0.05）；72h组的5pmol/l剂量组与对照组相比差异具有统计学意义（Plt;0.05）。

相同染毒剂量时，48h、72h的各剂量组与染毒12h的相同染毒剂量组相比差异具有统计学意义（Plt;0.05）。染毒48h、72h的各剂量组与染毒24h组的相同染毒剂量组相比差异具有统计学意义（Plt;0.05）。

各剂量组的细胞生长抑制率随着浓度的增加呈现递增趋势，且染毒浓度越高，趋势越明显。各剂量组的细胞生长抑制率在12 - 72h之间随着时间的增加而呈现递增的趋势。

3.3 MNNG对不同细胞活性的影响

同一染毒时间、染毒剂量下，Het-1A细胞和EC109细胞的生长抑制率不同，EC109细胞的生长抑制率普遍高于Het-1A细胞。

染毒12h后，EC109细胞与Het-1A细胞相比，除5pmol/l、5μmol/l外其他各染毒剂量组细胞生长抑制率具有统计学差异（Plt;0.05）。

染毒24h后，EC109细胞与Het-1A细胞组相比，5nmol/l、 500nmol/l、5μmol/l染毒剂量组细胞生长抑制率之间具有统计学差异（Plt;0.05）。

染毒48h后，EC109细胞所有染毒剂量组细胞生长抑制率，与Het-1A细胞组相比具有统计学差异（Plt;0.05）。

染毒72h后，EC109细胞 50nmol/l、5μmol/l染毒剂量组细胞生长抑制率，与Het-1A细胞组相比具有统计学差异（Plt;0.05）。

4 讨论

研究表明亚硝胺类物质与食管癌、胃癌等癌症的发生发展存在着紧密的关联。食物中和环境中都广泛存在着N-亚硝胺化合物。MNNG常用作研究亚硝胺类化学物的代表物质。已有的研究表明，MNNG可以呈剂量依赖性地抑制细胞的增殖并且诱导细胞的凋亡^[9]，甚至可以诱导细胞的恶性转化。目前国内外在MNNG与正常食管细胞方面的研究较多，主要研究MNNG代表的亚硝胺类物质诱导细胞的癌变。尹东等的研究发现，低浓度MNNG暴露下，正常细胞的生长抑制率不明显，但中高浓度抑制率明显^[10]。有研究表明MNNG可促使细胞DNA损伤，阻断细胞EGFR信号通路。但低浓度的MNNG不仅可以损伤DNA，也可以促使DNA发生修复反应。对于低浓度MNNG的作用、MNNG对癌细胞作用方面的研究相对较少，本研究观察低浓度MNNG对人正常食管上皮细胞株Het-1A和食管鳞癌细胞株EC109的细胞活性影响，分析不同细胞对亚硝胺物质的敏感性，为进一步研究亚硝胺对食管癌的作用机制提供依据。

本研究结果显示，低浓度MNNG暴露后，EC109的细胞抑制率普遍高于Het-1A细胞，表明人正常食管上皮细胞株Het-1A比食管鳞癌细胞株EC109有更强的抵御化学物质毒作用的能力。暴露于MNNG的时间越长则对细胞的生长抑制越明显，Het-1A细胞在72h时抑制率出现下降，可能与细胞的修复作用有关，也可能是由于染毒时间较长，96孔板孔内的细胞已长满，抑制率出现偏差。可适当减少细胞的种板数量进一步研究。正常细胞在低浓度下接触MNNG受到的影响较小，可能与低浓度下发生的DNA损伤修复有关。癌细胞更易受亚硝胺类物质的影响，可能与肿瘤细胞的细胞修复系统异常有关。因此，化学物质对不同种类受试细胞的作用差异较大，研究化学物质的细胞生物学效应时应考虑靶细胞的种类。

参考文献（References）

[1] 丁小云,蒋海忠. 努力提高消化道早癌的检出与诊断水平[J]. 现代实用医学, 2016, 28(7):844-846.

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