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目 录

1引言 4

1.1研究背景 5

1.2 国内外研究现状 5

1.3长江三角地区河蟹养殖规模 6

1.4 研究目的与意义 7

2实验材料与方法 7

2.1 实验仪器和材料 7

2.2样品采集和处理 8

2.3磺胺类抗性细菌耐药性实验 8

2.4磺胺类耐药细菌的基因组DNA提取实验 9

2.5水样和沉积物中的DNA提取实验 9

2.6磺胺类抗性细菌菌种鉴定实验 10

2.7 磺胺类抗性基因荧光定量PCR检测 10

3. 结果和讨论 11

3.1磺胺类抗性细菌总数及耐药率 11

3.2磺胺类抗性细菌的鉴定及分布 13

3.3河蟹养殖区磺胺类抗性基因的水平与分布特征 14

4. 结论及展望 16

参考文献： 17

致谢 19

南京某河蟹养殖水环境中磺胺类抗生素

抗性细菌及抗性基因初步研究

何绿林

（, China)

Abstract: In recent years, due to the sulfonamide antibiotics in the environment of abuse resistance gene pollution problems caused by the more and more serious, harm of sulfonamides resistance genes in the river crab aquaculture people have been paid more attention. Sulfa antibiotics, long-term excessive use of in river crab aquaculture, is likely to cause sulfonamide antibiotics resistance gene of Eriocheir sinensis in vivo, the excretion of crab breeding area and its surrounding environment caused serious pollution, but also to the public health, food and drinking water caused huge security risks. Therefore, this article mainly from crab breeding area of water and sediment samples were collected, water and sediment samples sulfonamide resistant bacteria identification and sulfonamides resistance genes preliminary study on the three aspects will sulfa antibiotic resistance gene as a new class of environmental pollutants, to Nanjing Gaochun solid around the lake crab aquaculture environment sulfa antibiotic resistance gene pollutants for analysis and detection, mainly by plate count method of sulfonamide resistant bacteria counting culture, sulfa drug resistance experiment, using the distribution of resistant gene in the fluorescence quantitative PCR detecting crab breeding area of water and sediment. Results solid lake city around the crab aquaculture environment sulfonamides resistance genes and resistant bacteria were detected, show the current situation and our country develop river crab aquaculture in sulfa antibiotic resistance gene pollution research and urgent to establish the relevant control measures.

Keywords: sulfonamide antibiotics；Antibiotic resistance genes( ARGs)；River crab aquaculture；New environmental pollutants

1引言

磺胺类药物是一类人工合成的抗菌药，其性质稳定、使用方便^[1]。磺胺类抗生素是畜牧业和水产养殖业中广泛使用的抗菌药物，具有较高水溶性、低螯合能力和低结合常数等特点，用于河蟹等动物后大部分磺胺类药物会以原药或代谢物的形式从动物体内排出，从而进入周围环境造成磺胺类抗生素的污染。它们在环境中的残留和长期存在，将迫使微生物产生耐药性，并可能通过基因水平转移方式传递到其他菌群，从而进一步通过食物链传递到人体，威胁人类生命安全。长期滥用磺胺类抗生素会导致动物体内和环境中磺胺类耐药菌(Antibiotics Resistant Bacteria，ARB)大量繁殖，诱导其产生抗生素抗性基因(Antibiotics Resistance Gene Screening，ARGs )，从而对河蟹养殖区域及其周边环境造成不可忽视和估量的基因污染。ARGs不仅破坏了各种微生物种群数量和结构的平衡，而且一旦传递进入人类致病菌内，将降低感染性疾病治愈的可能性，对人体健康造成非常严重的威胁^[2]。2011年世界卫生日抵御耐药性的主题呼吁了遏制磺胺类抗生素耐药性蔓延的迫切性。

现如今，在医院废水、畜牧业产生的废水、水产养殖场特别是河蟹养殖中都发现了磺胺类抗性基因的存在。磺胺类抗生素对人体及动物都起着至关重要的作用，但是由于磺胺类抗生素在生产过程中遇到了许多困难，导致在对其使用和生产中产生大量污染物，所以对医院废水中磺胺类抗生素的处理也成为了当务之急。

Nicholas 等^[3]发现磺胺类抗性基因的含量具有随季节变化的特点，秋天水产养殖业中磺胺类抗性基因比夏天高出了十倍甚至百倍。在部分其他国家的水产养殖场的水样中，磺胺类抗性基因也都有检出^[4]，在美国，某奶牛场分离出的产单核细胞中出现了多种 ARGs，包括sul I(占16%)、tet A(占32%)、str A（占34%）、pen A(占37%)和flo R(占66%) ^[5]。

人类活动的干预会直接导致磺胺类抗性基因产生得更多、传播得更广泛。Pruden 等^[6]采用 PCR定量实时监测技术对含有磺胺类抗生素的河流内沉积物、饮用水处理厂等的磺胺类抗生素抗性基因的浓度进行了调查研究，实验表明，在有人类活动干预环境中磺胺类抗性基因的浓度要比没有受到人类活动干扰的地区磺胺类抗性基因的浓度高出很多。在河蟹养殖业大量使用磺胺类抗生素的过程中，大多磺胺类抗生素都没有被河蟹等动物吸收而直接排出到周围环境，并对周围环境的微生物造成选择性压力，以致在环境中诱导产生具有磺胺类抗性基因的微生物，其中小部分的磺胺类抗生素可以直接诱导河蟹等动物体内的微生物产生磺胺类抗性基因，具有磺胺类抗性基因的微生物便随河蟹等动物所排泄的粪便进入河蟹养殖环境中^[7]。

1.1研究背景

磺胺类抗生素是30年代发现的能有效治疗细菌感染的第一类药物，磺胺类药物对治疗一些感染性疾病具有很好的效果，因此其在抗感染的药物中占有很高的地位。磺胺类抗生素因其能够有效防治河蟹动物的细菌性疾病和促进河蟹生长的功效而被广泛应用于河蟹养殖业中，在一定程度上促进了我国河蟹养殖业的发展^[8]。然而，随着磺胺类抗生素的广泛普及和过度使用，其引起的水环境污染和危害人体健康等诸多问题渐渐受到相关研究人员的关注和重视。磺胺类抗生素是生物在其生命、生活等活动过程中产生的一些可以在较低浓度下有选择性地抑制或者影响其他种类生物功能的有机物质 ^[9]。

磺胺类药物除了广泛应用于人类疾病的预防及治疗，还普遍应用于河蟹养殖业当中。据调查，我国每年的抗生素使用量大概是4万吨，约占全世界每年抗生素使用量的三分之一。由此可见，我国已经是抗生素的生产和使用大国，而我国磺胺类抗生素的产量在2003年就超过了2万吨^[10]。虽然磺胺类抗生素可使用的范围很广，但其另一方面所体现出来的毒性和副作用也同样不容小视!磺胺类药物能影响泌尿系统的功能，具有很高的致癌性，磺胺类抗生素一旦被身体吸收后将广泛分布在全身各个器官和组织当中，且在身体中持续时间很长。磺胺类抗生素能透入脑膜积液和其他积液中造成血尿等疾病，还能通过母体营养的传输对孕妇和婴儿的健康和生命安全造成非常严重的危害，更容易在尿液中析出晶体导致结石而损害肾脏。

终上所述，磺胺类抗生素作为环境中的外源性化合物对河蟹养殖环境中的生物及生态都产生了严重的影响，更可怕的是会对人类健康和生存造成无法想象的威胁和无法估量的损失^[11]。

1.2 国内外研究现状

磺胺类化合物最早报道于1906年，其结构中有对氨基苯磺酰胺母核，最开始是作为染料来使用的。至1932年，磺胺类化合物的抗感染的作用被德国拜耳公司的多马克发现，于是便开始用于治疗由葡萄球菌引起的败血症。在其后的研究中显示：磺胺类化合物具有广谱抗革兰氏阳性和阴性菌的作用，因此吸引了许多相关研究人员的关注和调查研究，并在此后的十多年时间里开发出了包括磺胺吡啶、磺胺嘧啶和磺胺噻唑等抗菌药物，直到后来，磺胺类药物品种就已经超过了5400种，其中常见的有磺胺吡啶、磺胺酰胺、磺胺噻唑等。在繁多的河蟹养殖业中，不管是发达国家还是发展中国家，磺胺类药物都经常被单独使用或者是同其它抗菌药联用来预防和治疗腹浑等多种感染疾病。

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