高淳和金坛中华绒螯蟹养殖区微生物多样性特征研究

论文总字数：20983字

目 录

1.引言 4

1.1 研究背景 4

1.2国内外研究现状 5

1.3研究的目的和意义 6

2．实验材料和方法 7

2.1采样点信息、抽样和DNA提取 7

2.2 Illumina Miseq的16S rRNA基因测序 8

2.3 细菌群落分析 8

2.4 统计分析 8

3. 结果 9

3.1微生物群落的多样性、丰富度与结构 9

3.2共享的OTUs和 独有的OTUs 11

3.3 潜在病原菌分析 13

4. 讨论 13

4.1 门水平上的分类讨论 13

4.2 OTUs水平上的分类及共享OTUs讨论 14

4.3群落结构中潜在的病原菌讨论 14

5.结论与展望 15

参考文献： 16

致谢 18

高淳和金坛中华绒螯蟹养殖区

微生物多样性特征研究

陈孟高山

（, China)

Abstract: In recent years, the vicious competition in the aquaculture industry has led to a series of environmental problems including antibiotic resistance pollution. At resent, most of the regional studies related to the microbial diversity of aquaculture waters in China are concentrated in the culture of fish and shrimp, and the environment for crab culture is less concerned. In this paper, the characteristics of microbial diversity in three typical mitten crab culture areas of Gaochun and Jintan in Jiangsu Province were analyzed by means of high-throughput sequencing (16S rRNA amplicon sequencing)metagenomics. The results showed that the microorganisms in these culture ponds were more diverse in colony structure than other environments, and the shared OTUs in water and sediment samples accounted for a large proportion of OTUs in water samples. The potential pathogenic bacteria in these cultured environments are mostly conditional pathogens, which have the potential to increase the resistance gene's entry into pathogenic bacteria through horizontal transfer, and at the same time may change the biodiversity and community structure in the aquatic environment, which also indicates that it has potential Risk of illness. This study can help to further isolate the dominant flora for reducing the pollution, and provide the basis for further study of the antibiotic resistance genes in water environment pollution risk and ecotoxicity evaluation.

Keywords: Chinese mitten crab; 16S rRNA gene sequencing; Microbial diversity; Potential pathogenic bacteria

1．引言

我国自古就有食用中华绒螯蟹的记载，那时中华绒螯蟹多通过自然捕捞获得。而我国中华绒螯蟹养殖始于20世纪60年代后期和70年代初期^[1]。当时，人们依赖于天然蟹苗并对湖泊、河流和含草河道等大水面进行人工放流，从而提供中华绒螯蟹产品。随着我国国民生活水平的日益提高，人们对中华绒螯蟹的需求也随之增加。我国的中华绒螯蟹养殖也因此经历了天然蟹苗人工增殖阶段、蟹苗的人工繁殖养殖阶段、河蟹养殖高速发展阶段和大闸蟹生态高效养殖阶段这四个主要阶段^[2]。随着近几年它的快速增长，在2016年时我国中华绒螯蟹的产值已达到100亿美元。纵观这几年，虽然中华绒螯蟹的养殖产量增长很快，但盲目追求产量而造成的问题也十分令人担忧。不当的养殖不但会使中华绒螯蟹养殖遭遇病害等重大损失，还会对周边环境产生重大影响。其中由于养殖不当而造成的水域污染、大面积水域富营养化和抗生素大量使用导致抗性基因污染等例子也已经屡见不鲜。要想解决好该类问题，我们有必要对典型中华绒螯蟹养殖环境进行考察和研究。

微生物在养殖环境中同时担任初级生产者、分解者和消费者这三种身份，在养殖环境的物质循环、能量流动和信息传递中起着重要的作用。我们只有对养殖环境中的微生物有了深刻的研究，才能更好的改善养殖环境并解决上述问题。而水产养殖环境中的微生物研究集中在微生物（特别是病原体）与真核生物（如鱼类和甲壳类动物）之间的相互作用^[3]。因此有必要研究典型蟹塘环境中微生物的多样性和群落结构，从而为解决上述问题提供帮助。

在这项研究中，我们使用Illumina高通量测序技术研究了中国江苏省3种中华绒螯蟹养殖环境中的微生物群落组成， 并在Illumina Miseq平台上进行了细菌16S rRNA基因扩增子测序，从而对江苏典型的中华绒螯蟹养殖环境中的微生物群落结构进行全方位的解析。

1.1 研究背景

中国是世界上最大的水产养殖生产国，其产量为4.55×10⁷吨，占世界总产量的61.62％（FAO，2016）。 江苏是中国水产养殖最重要的省份之一，其水产品产量为5.21×10⁶吨（NBSC国家统计局，2016）。特别的是，中华绒螯蟹是中国流行的淡水产品，而江苏省中华绒螯蟹每年的产量占全国年总产量一半左右。中华绒螯蟹又名河蟹，是一种家喻户晓的经济型蟹类。其螯足用于取食和抗敌，掌部内外缘密生绒毛，绒螯蟹因此而得名^[4]。河蟹在我国各地的江河湖泊中均有养殖，其中长江水系的养殖规模尤为突出。而金坛的长荡湖大闸蟹和高淳的固城湖大闸蟹都是其中典型的佼佼者。两地的中华绒螯蟹味道鲜美，肉质饱满，且富含丰富的维生素A、蛋白质和钙质等，从而能够预防皮肤角化、儿童佝偻病以及老年人易得的骨质疏松病等^[５]。因此食用中华绒螯蟹能够在让人在大快朵颐的同时，还能满足人体的多种营养需求。

想要吃上鲜美的中华绒螯蟹就一定离不开水产业。水产业在人类生活与社会中有着举足轻重的地位。水产业主要包括水产捕捞和水产养殖。人们的过度捕捞导致了自然的内陆淡水水产面临枯竭，而又伴随着人们对虾、蟹、鱼等水产品的需求不断提高，此时人工水产养殖可以很好的应对这种窘境。随着水产养殖业的肆意壮大和恶性竞争，废水污染养殖水体、缺乏规划和设计、不合理投放饲料与药物等行为都使得水产养殖业引发了一系列的环境问题^[6]。而引发的环境问题又会反过来直接或间接的影响水产品的质量与数量。目前，控制水产养殖环境的污染与水产品的合理病害防治已经成为养殖的关键。

微生物是自然界分布非常广泛的一类生物，其具有个体最小、数量最庞大、种类十分繁多的特性，对整个大自然的平衡与循环有着举足轻重的作用。因此微生物在水产养殖中仍然担任着十分重要的角色。微生物生态环境情况的好坏可能会直接或间接地影响养殖环境的状况。一方面，微生物可以作为分解者、生物标志物、污水处理物、益生菌和养殖物的直接食物等。另一方面，正常情况下致病细菌不能大量生长，否则很有可能引起水产品的大量死亡。此外养殖塘水中和底泥中的生物大量繁殖，需要消耗大量的溶解氧，有可能会使水产品供养不足并且可能会产生硫化氢等有害物质来污染水体环境^[7]。

微生物群落的多样性对其所在的生态系统变化有着十分重要的影响^[8]。通过对微生物多样性研究，可以发现微生物群落变化和其所在环境变化之间的关系，从而可以起到监控环境状态、污染、变化的目的。此外，微生物多样性分析对未知种群的探明也十分有帮助，从而可以将其中未被利用的资源加以开发。因此，及时了解养殖环境的微生物的种群结构和多样性的生态状况以及微生物与其他环境因素的关系显得尤为重要，这也对养殖环境的污染状况的修复有着十分重要的意义。

然而99%环境中的细菌不容易被培养，因此生物多样性在以前很难被用来做基础研究。虽然前人已经做了许多获取有关生物多样性和动态方面信息的努力，但是例如传统的修饰和选择培养基、培育和分离技术以及成像技术很难用于解决以上的问题。因此，如果想让微生物向人们所需的方向发展，并能促使养殖业经济效益的提高，则需要人们不断采用最前沿的技术来进一步了解养殖环境中的微生物。现代分子生态学的方法在基因水平上研究微生物群落的多样性与结构动态，极大的推动了微生物多样性研究的步伐。

1.2国内外研究现状

剩余内容已隐藏，请支付后下载全文，论文总字数：20983字