论文总字数：27555字

摘 要

晚期乳腺癌治死率较高，因此乳腺癌的早期诊断是治疗乳腺癌的重要方法。传统的检测方法虽然操作简单，但特异性不强、灵敏度不高，因此，仍需研究开发新的诊断技术。随着科学技术的发展和人类对癌症认识的深入，涌现出许多非侵入式体外检测方法。microRNA-21是一种新兴的乳腺癌肿瘤生物标志物。本文构建了一种基于Au纳米颗粒和氮化碳纳米片（AuNPs/CNNS）纳米复合材料和双重特异性核酸酶（DSN）辅助目标物再循环的高灵敏度的电化学生物传感器。用亚甲基蓝（MB）修饰的DNA探针（cDNA）作为电化学信号分子。与目标物杂交后，DSN可识别并水解DNA-RNA杂交体中的cDNA，并去除MB信号分子，从而降低方波伏安法（SWV）测试中的峰电流。在最佳条件下，生物传感器显示miRNA-21的检测范围为10fM至1nM，检测限低至3fM，这是由于高效的目标特循环和高电导率、稳定性、均匀性的AuNPs/CNNS纳米复合材料的。最后，生物传感器也用于检测血清样品中添加的miRNA-21，表明其可用于疾病的早期诊断。

关键词： 乳腺癌、早期诊断、氮化碳纳米片、金纳米粒子、电化学生物传感器

Abstract

The mortality rate of advanced breast cancer is high, so early diagnosis of breast cancer is an important method to treat breast cancer. Although the traditional detection methods are simple to operate, they are not specific and sensitive. Therefore, new diagnostic techniques need to be developed. With the development of science and technology and the deepening understanding of cancer, many non-invasive in vitro detection methods have emerged. microRNA-21 is a new biomarker of breast cancer. A highly sensitive electrochemical biosensor based on Au nanoparticles and carbon nitride nanosheets (AuNPs/CNNS) nanocomposites and dual-specific nuclease (DSN) assisted target recycling was constructed. Methylene blue (MB) modified DNA probe (cDNA) was used as electrochemical signal molecule. After hybridization with the target, DSN can recognize and hydrolyze the DNA-RNA hybrids and remove MB signal molecules, thus reducing the peak current in square wave voltammetry (SWV) test. Under the optimum conditions, the biosensor showed that the detection range of microRNA-21 was from 10fM to 1nM, and the detection limit was as low as 3fM. This was due to the high target specific cycle and high conductivity, stability and uniformity of AuNPs/CNNS nanocomposites. Finally, biosensors are also used to detect the addition of microRNA21 in serum samples, indicating that they can be used for early diagnosis of diseases.

Key words : Breast cancer, early diagnosis, carbon nitride nanotablets, gold nanoparticles, electrochemical biosensors

目 录

摘要 II

Abstract III

第一章 绪论 1

1.1 引言 1

1.2 研究背景 2

1.2.1 乳腺癌 2

1.2.2 电化学生物传感器 4

1.2.3 microRNA 6

1.2.4 纳米材料 9

第二章 实验部分 11

2.1 实验试剂 11

2.2 实验仪器 11

2.3 AuNPs和CNNS修饰电极（AuNPs/CNNS/GCE）的制备 11

2.4 microRNA生物传感器的构建 12

2.5 本章小结 13

第三章 结果和讨论 14

3.1 AuNPs/CNNS的特性 14

3.2 microRNA检测方法的可行性 15

3.3 生物传感器的电化学特性 15

3.4 实验条件优化 17

3.5 miRNA生物传感器的分析性能 19

3.6 miRNA生物传感器的稳定性、选择性和再现性 21

3.7 本章小结 23

第四章 总结与展望 25

4.1 总结 25

4.2 展望 25

参考文献 26

致 谢 28

绪论

引言

癌症是细胞恶性增长引起的疾病，可能扩散到身体的其他部位。研究表明，约90-95％的癌症病例，是由于环境和生活方式因素导致的基因突变。剩下的5-10％是由遗传引起的。导致癌症死亡的常见环境因素包括烟草、饮食和肥胖、感染、辐射（电离和非电离）、环境污染等。乳腺癌是发生在乳腺腺上皮组织的恶性肿瘤，是全世界女性最常见的恶性肿瘤。“据世界卫生组织国际癌症研究中心(International Agency for Research on Cancer，IARC)统计，2008年全球女性乳腺癌新发病例达138万，占全部女性恶性肿瘤发病的22.9%；46万女性因乳腺癌死亡，占所有女性恶性肿瘤死亡的13.7%，占所有女性死亡的1.7%”[1]。早期诊断、早期治疗是提高乳腺癌患者生存率最重要的手段。目前，常用的早期诊断方法主要有：X光诊断、超声波诊断、细胞学诊断、CT诊断、磁共振成像（MRI）诊断、CTC循环肿瘤细胞检测等。这些方法虽然简便可行，但是灵敏度较低，难以准确诊断出早期癌症，且在取材上存在局限性。自从1962年美国科学家Clark研制出葡萄糖氧化酶（GOx）生物传感器后[2]，经过数十年的发展，生物传感器具有特异性强、灵敏度高、检测限低、检测时间短、信号强度大等优点，被广泛应用于疾病诊断、医疗卫生、环境监测等领域。

miRNA是一类长度约为18-24个核苷酸的非编码单链RNA分子，由内源基因编码，可调节细胞增殖，分化和凋亡。最近的研究表明，miRNA以碱基互补形式识别并结合靶分子，导致其表达上升或下降，从而调节肿瘤发生。总之，miRNA的异常表达与各种癌症，基因疾病和免疫功能低下有关。因此，miRNA是一种新兴的肿瘤生物标志物，可用于早期诊断和预后，其敏感性和选择性分析有利于研究人员了解miRNA相关癌症并发现新药。然而，检测miRNA的内在特性仍然是一个巨大的挑战，包括家族成员之间的短长度，低富集和序列同源性。有几种常规的miRNA分析方法，例如，实时逆转录聚合酶链反应（RT-PCR），Northern印迹和微阵列技术。然而，这些方法通常是耗时的，高成本，昂贵的设备要求，低灵敏度和误报信号。

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