论文总字数：21204字

摘 要

B7-H4是最新发现的B7家族成员，根据目前研究，其广泛存在于人的肿瘤组织及肿瘤细胞中，负性调节T细胞的活化，介导肿瘤细胞的免疫逃逸等。利用此免疫检查点来制备其相应的免疫检查点抑制剂，可能成为新的肿瘤治疗药物。而抗体是最通用的抑制剂药物。通过免疫B7H4抗原，细胞融合及筛选，我们获得了能表达高亲和抗体的克隆细胞株。为后续单克隆化及抗体的人源化奠定了基础。

关键词：B7-H4；免疫检查点抑制剂；单克隆抗体；

B7H4 monoclonal antibody preparation

Abstract

B7-H4 is a new member of the B7 family and it is a immune checkpoint. According to the current research, it is widely expressed in human tumor tissues and cells. It negatively regulate the activation of T cells and mediate the tumor immunity escape. The immune checkpoint inhibitor to B7-H4 may be a new drug for cancer therapy. Antibodies are the most common inhibitors. By mouse immunization with B7H4 antigen, cell fusion and screening, we obtained clones which express high affinity antibody. It laid the foundation for subcloning and antibody humanization.

Keyword：B7-H4；Immune Checkpoint Inhibitor；Monoclonal Antibody；

目 录

中文摘要 I

Abstract II

目 录 III

第一章 引言 1

1.1肿瘤的治疗策略 1

1.2免疫检查点 1

1.3单克隆抗体制备 4

1.4本次研究的内容及目的 4

第二章 抗原的制备 5

2.1 SDS-PAGE凝胶电泳 5

2.1.1实验目的 5

2.1.2实验材料 5

2.1.3实验仪器 5

2.1.4实验方法 5

2.1.5实验结果 6

2.2 Western Blot 7

2.2.1实验目的 7

2.2.2实验材料 7

2.2.3实验仪器 7

2.2.4实验方法 8

2.2.5实验结果 9

2.3结果分析 9

第三章 小鼠免疫 10

3.1小鼠免疫 10

3.1.1实验目的 10

3.1.2实验材料 10

3.1.3实验方法 10

3.1.4实验结果 11

3.2滴度测定 11

3.2.1实验目的 11

3.2.2实验材料 11

3.2.3实验仪器 12

3.2.4实验方法 12

3.2.5实验结果 12

3.3结果分析 14

第四章 细胞融合及杂交瘤细胞筛选 15

4.1细胞融合及筛选 15

4.1.1实验目的 15

4.1.2实验材料 15

4.1.3实验仪器 15

4.1.4实验方法 15

4.1.5实验结果 16

4.2 Elisa 17

4.2.1实验目的 17

4.2.2实验材料 17

4.2.3实验仪器 17

4.2.4实验方法 17

4.2.5实验结果 18

4.3 FACS 19

4.3.1实验目的 19

4.3.2实验材料 19

4.3.3实验仪器 19

4.3.4实验方法 19

4.3.5实验结果 20

4.4结果分析 21

第五章 总结与展望 22

致 谢 23

参考文献 24

第一章 引言

1.1肿瘤的治疗策略

人们越来越认识到免疫系统在癌症的发生和发展中起着至关重要的作用^[1]。导向致癌的路径首先是从基因组不稳定开始，它可以是由致癌基因和条件致癌因子如慢性炎症引发的。1.作为恶性转化过程的延续，免疫系统在检测和破坏表达了与DNA损伤相关配体的细胞中起到重要作用^[2]。2.然而，这种免疫监视导致恶性细胞筛选，获得弱免疫原性或开发逃避免疫系统的检测的机制。最终结果是一个恶性肿瘤逃其避免疫检测^[2]和破坏，快速增殖及其临床表现为癌症。

癌症的治疗在很大程度上依赖于杀死肿瘤细胞的非特异性细胞毒性疗法和放疗^[3]。但是，这种方法有局限性，包括严重的全身毒性，对于正常细胞的旁侧效应、耐药肿瘤细胞的复发和对于微转移或亚临床疾病的靶向不能^[4]。因此在对癌症免疫的认识增加的同时，人们更强烈研究针对癌症的免疫疗法，以追求更有效和更耐受的治疗策略。这些免疫治疗剂一般分为两大类：被动免疫-免疫活性成分提供给病人，以及主动免疫治疗-即给与的成分能够主动刺激产生新的免疫应答。被动免疫疗法应用广泛，包括很多药物，已经由美国食品和药物管理局（FDA）批准，如单克隆抗体：贝伐单抗（抗–VEGF）、曲妥珠单抗（抗-EGFR2）^[5]，西妥昔单抗（抗–EGFR）和利妥昔单抗（抗–CD20阳性淋巴细胞）。然而，尽管这些生物制剂结合肿瘤细胞中过度表达的靶标，但是这些配体通常也在正常组织中表达。因此，严重的毒性反应和耐药性也在许多患者中产生，从而使治疗无法长期进行^[6]。

早期的癌症患者自发性缓解的报告中表明免疫系统刺激后可以产生一个强大的，高度特异性的，针对与癌症的持久反应^[4]。1891年初，William Coley博士观察到，一些并发细菌性皮肤感染的肉瘤患者有自发缓解癌症的迹象。或许这是由于刺激了的免疫反应不仅针对细菌感染也针对肿瘤。这最终为主动免疫治疗方法铺平了道路，包括细胞因子、肿瘤抗原疫苗和过继性细胞转移治疗。直到免疫检查点抑制剂的出现，高剂量的白细胞介素-2（一种细胞因子）是FDA唯一批准的全身治疗，其对于IV期除了睾丸癌以外的实体瘤肿瘤中出现了持久的完全缓解^[7,8]。然而，其缓解率较低（5–7%），治疗是难以耐受的，并且难以预测病人是否会产生应答反应。肿瘤抗原疫苗已经在动物模型的癌症取得了极大的进展；然而，只有唯一一种疫苗被批准-治疗性疫苗sipuleucel-T，一种针对转移性前列腺癌治疗的过继细胞转移疗法。其他许多肿瘤抗原疫苗进行了研究；然而没有达到类似的可以被批准的疗效，虽然有几个已经被证明在通过感染在预防癌症上是有效的（例如，人乳头状瘤病毒）。

目前公认的肿瘤有抑制抗肿瘤免疫反应的多种机制，包括抑制性细胞因子的分泌，抑制免疫细胞的产生以及上调的免疫检查点-共抑制受体^[9]。这些抑制机制被认为是一些主动免疫疗法临床失败和普遍性的癌症进展的主要因素。对这些机制的进一步了解之后，发展出了靶向肿瘤相关免疫抑制的疗法。目前，临床上最成功的疗法就是免疫检查点抑制剂疗法。

1.2免疫检查点

适应性免疫反应的主要效应细胞是对抗癌症的T淋巴细胞，包括辅助性T细胞和细胞毒性T淋巴细胞（CTL）。辅助性T细胞在传递肿瘤免疫应答中发挥重要的作用，而细胞毒性T淋巴细胞有直接的肿瘤细胞的杀伤能力。这两种类型的细胞的功能都需要通过主要组织相容性复合体（MHC）受体来进行识别。这种T细胞启动和激活过程是通过T细胞受体（TCR）和抗原/MHC抗原提呈细胞（APC）的复合物的相互作用来进行的^[9]。重要的是，T细胞启动/激活是通过称为免疫检查点的共刺激或共抑制性信号来进行严格监管的（如图1.1）。当TCR与抗原/MHC结合伴随着共刺激受体的参与，这个结果是启动和激活了T细胞来针对特异性抗原。相反，当TCR与抗原/MHC结合是伴随着抑制性受体的参与，如细胞毒性淋巴细胞相关蛋白-4（CTLA-4），这个结果则是抑制了T细胞^[10]。CTLA-4受体在许多癌症中过度表达，这种受体的激活导致自然和记忆T细胞功能的抑制作用，因此有助于肿瘤抗原对于T细胞的耐受^[10]。

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