论文总字数：25021字

摘 要

目的：构建和提取重组质粒pCAS-Guide-EF1α-GFP/HSP60gF₂R₂和pCAS-Guide-EF1α-GFP/Scramble FR，为pCas--向导系统在基因组编辑中的应用奠定基础。方法：将单个的寡核苷酸DNA链，经过退火处理，使其恢复为双链结构，获取所需要的insert；限制性核酸内切酶BamHI、BsmBI双酶切质粒pCAS-Guide-EF1α-GFP，DNA片段纯化回收获得目的载体；在T4 DNA连接酶的作用下，将双链DNA寡核苷酸链（即insert），定向插入载体相应的位点中，获得重组表达质粒；将其转化至大肠杆菌 DH5α中，涂布到选择性固体培养基（LB琼脂 AMP）上进行过夜倒置培养，从而获取克隆菌落；从克隆菌落中挑取单菌落，经PCR鉴定后，送去测序进行分析；提取重组质粒pCAS-Guide-EF1α-GFP/HSP60gF₂R₂和pCAS-Guide-EF1α-GFP/Scramble FR，进行琼脂糖凝胶电泳分析。结论：1）PCR 扩增片段出现约 1.2kb 大小的目的基因条带，与理论计算的结果相同；2）琼脂糖凝胶电泳证实重组质粒构建成功；3）经过测序可以得出，质粒中融合的insert的序列与理论序列相同。结论：成功构建和提取重组质粒pCAS-Guide-EF1α-GFP/HSP60gF₂R₂和pCAS-Guide-EF1α-GFP/Scramble FR 。

关键词：基因组编辑；重组质粒；构建；提取

Construction and Extraction of pCAS-Guide-EF1α-GFP of Recombinant plasmid

Abstract

Aim：Construction and extraction of recombinant plasmid pCAS-Guide-EF1α-GFP /HSP60gF2R2 and pCAS-Guide-EF1α-GFP/Scramble FR to lay the foundation for the application of pCas--system in genome editing in the wizard. Methods：The single chain oligonucleotide DNA, after annealing treatment, the recovery of doublechain structure, to obtain the required insert. The restriction endonuclease of BamHI and BsmBI digested plasmid pCAS-Guide-EF1α-GFP, DNA fragment was recovered and purified to obtain the desired carrier. In the role of T4 DNA ligase, the double-stranded DNA oligonucleotide was cloned into the corresponding sites of vector to obtaine recombinant plasmid. It is transformed into E. coli DH5, and cultured overnight inversion applied to selective solid medium (LB agar AMP), so as to obtaining clonal colonies. Single colonies were picked from cloned colonies, after PCR amplification, sent for sequencing analysis. Extracting recombinant plasmid pCAS-Guide-EF1α-GFP/HSP60gF₂R₂ and pCAS-Guide-EF1α-GFP/Scramble FR were analyzed by agarose gel electrophoresis. Results：

1）Genes was amplified by PCR to a size of about 1.2kb, the same result with the theoretical calculations. 2）Agarose gel electrophoresis confirmed that the recombinant plasmids were successfully constructed. 3) After sequencing, it can be concluded that fusion plasmid insert sequence identical with the theoretical sequence. Conclusion：Successfully constructed and extracted the recombinant plasmids of pCAS-Guide-EF1α-GFP/HSP60gF₂R₂ and pCAS-Guide-EF1α-GFP/Scramble FR.

Key words: Genome Editing；The recombinant plasmid；Construction；extraction

目 录

摘 要 I

Abstract II

第一章 引 言 1

1.1 CRISPR/Cas9系统 1

1.1.1 CRISPR/Cas9技术简介 1

1.1.2 CRISPR/Cas9研究历史 1

1.1.3 CRISPR/Cas9研究领域 1

1.2 质粒重组技术简介 1

1.2.1 DNA重组技术 1

1.2.2 限制性核酸内切酶及酶切反应 2

1.2.3 载体与外源DNA的连接反应 2

1.2.4 感受态细胞的制备及质粒转化 2

1.2.5 重组转化子的筛选与验证 2

1.3本次研究的内容及目的 2

第二章 获取insert和线性化的载体 4

2.1实验设计 4

2.2实验材料 4

2.2.1 实验试剂及耗材 4

2.2.2 实验仪器 5

2.3实验方法 6

2.3.1基因的合成 6

2.3.2 获取insert 6

2.3.3 QIAGEN试剂盒提取质粒pCAS-Guide-EF1α-GFP 6

2.3.4 紫外分光光度计测定质粒pCAS-Guide-EF1α-GFP的OD值和浓度 8

2.3.5 琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒pCAS-Guide-EF1α-GFP 9

2.3.6 获取线性化的载体 10

2.4实验结果及分析 11

2.4.1 紫外分光光度计测定质粒pCAS-Guide-EF1α-GFP的光密度和浓度 11

2.4.2 质粒pCAS-Guide-EF1α-GFP电泳鉴定 11

2.4.3 线性化的载体电泳鉴定 12

第三章 重组质粒pCAS-Guide-EF1α-GFP系列的构建 13

3.1 实验设计 13

3.2 实验材料 13

3.2.1 实验试剂及耗材 13

3.2.2 实验仪器 14

3.2.3 溶液配制 15

3.3 实验方法 15

3.3.1 CaCl₂法制备感受态细胞并验证其效率 15

3.3.2 目的基因和载体的连接 16

3.3.3 转化 17

3.3.4 PCR鉴定 18

3.3.5 测序 19

3.4 实验结果及分析 19

3.4.1 感受态细胞效率的验证 19

3.4.2 转化 19

3.4.3 PCR鉴定 20

3.4.4 测序鉴定 20

第四章 重组质粒pCAS-Guide-EF1α-GFP-hsp60系列的提取 21

4.1 实验设计 21

4.2 实验材料 21

4.2.1实验试剂及耗材 21

4.2.2实验仪器 21

4.3 实验方法 22

4.3.1 TakaRa试剂盒提取重组质粒 22

4.3.2 琼脂糖凝胶电泳鉴定重组质粒 22

4.4 实验结果及分析 23

4.4.1琼脂糖凝胶电泳鉴定重组质粒 23

第五章 结 论 24

致谢 25

参考文献 26

引 言

1.1 CRISPR/Cas9系统

1.1.1 CRISPR/Cas9技术简介

最新基因组编辑工具——CRISPR/Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Cas9）系统，是一种应用十分广泛、操作简易、可以分割和变换特定基因组位点的系统，它也是细菌和古细菌针对病毒和质粒的连续进攻而不断演变进化产生的获得性免疫防御机制。该系统具有特异性高、细胞毒性低的特点。Cas9转录激活因子样效应物核酸酶作为由RNA指导的双链DNA结合蛋白，能够对RNA、DNA 和蛋白质实现共定位，因而具有潜在的改造能力。蛋白质与不含核酸酶的Cas9互相融合，同时表达出适当的向导RNA，能够在任何靶位点剪切和靶定双链DNA，而RNA能够连接到向导RNA的末端，却不影响Cas9的结合。因此，它能够在双链DNA的任意序列处插入融合蛋白和RNA，为实现基因组编辑提供了巨大方便。

1.1.2 CRISPR/Cas9研究历史

CRISPR/Cas9基因组编辑系统起源于Ⅱ型CRISPR系统。Cas9蛋白是利用该系统进行基因组编辑的关键点，它源于产脓链球菌和嗜热链球菌中。2012年，美国Lawrence Berkeley国家实验室的研究人员将crRNA-tracrRNA双链RNA复合体改造为单链嵌合体，同时将这条人工改造的单链RNA命名为指导RNA（即Guide RNG，gRNA）。这一发现为进一步改造和利用该系统进行基因组编辑打下了坚实的基础。

1.1.3 CRISPR/Cas9研究领域

多个研究小组的实验结果证明，在人类细胞中进行基因组编辑的效果较为理想。这些研究涉及各种不同类型的细胞（如癌症细胞以及诱导多功能干细胞）、各种不同基因位点（如已经通过AFNs或者TALENs成功进行修饰的基因位点）和多种修饰方式（如基因敲除、同源重组、定点整合、大片段删除以及多基因同时敲除等），这充分说明了该技术在人类细胞基因组编辑中的强大作用。

在利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术制作基因打靶小鼠上，中国科学家走到了世界前沿。南京大学的研究团队通过实验最先获得了1只定向敲除单拷贝外源基因的嵌合鼠，证实了Cas9蛋白能够在小鼠胚胎中产生活性，同时实现了利用该基因组编辑系统培育基因打靶小鼠的可操作性。美国科学家通过向小鼠的胚胎干细胞中融合CRISPR和Cas9的RNA，达到同时敲除5个内源基因的目标，实现了高达10%的靶定效率。

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