论文总字数：6543字

摘 要

：本文通过液相合成的方法设计合成了甘氨酸-半胱氨酸二肽，主要利用氨基酸氨基与NHS活性酯反应生成肽键并根据氨基酸的性质，在反应过程中需要对甘氨酸的氨基进行Fmoc保护并在反应完成后脱去。利用H-NMR核磁共振来确定合成产物的结构，以及ESI质谱来确定产物的分子的摩尔质量大小。从而确定最终产物与合成目标产物的一致性。

关键词：甘氨酸、半胱氨酸、Fmoc保护、核磁共振、质谱

Abstract： The glycine-cysteine dipeptide was synthesized using liquid phase method, and the peptide bonds was formed by the reaction between amino-group and NHS active ester. The amino-group of glycine was protected by Fmoc, which was removed after the reaction. H-NMR was used to determine the structure of synthetic products, and molecular mass of the dipeptide was confirmed by ESI-MS

Key words: glycine, cysteine, Fmoc protection, nuclear magnetic resonance, mass spectrometry

目录

1 前言 3

1.1 背景 3

1.2 固相合成的原理 3

1.3 固、液相合成的优缺点 4

1.3.2 固相合成的缺点： 4

1.3.3 液相合成的优点： 4

1.3.4 液相合成的缺点： 5

1.4 Fmoc保护基的优点 5

1.5 氨基酸的种类及性质 7

1.5.1 氨基酸的种类 5

1.5.2 氨基酸的理化性质 6

1.6 核磁共振的原理及其种类 6

1.6.1 核磁共振的原理 6

1.6.2 核磁共振的种类 7

2.1 仪器 7

2.2 试剂 7

2.3 合成过程 7

3核磁共振图谱与质谱表征结果 8

1 前言

1.1 背景

多肽合成其实是一个重复添加氨基酸的过程，固相合成顺序一般从C端（羧基端）向 N端（氨基端）的合成。从固相多肽合成方法制作成功以来，经过不断的改进和完善，到现在固相法已成为多肽和蛋白质合成中的一个常用技术，体现出了经典液相合成法无法比拟的优点，从而大大的减轻了产品提纯的难度。多肽合成总体上来说分成两种：固相合成和液相多肽合成。

多肽是一种与生物体内各种细胞功能都相关的生物活性物质，它的分子结构介于氨基酸和蛋白质之间，是由多种氨基酸按照一定的排列顺序通过肽键结合而成的化合物。多肽是涉及生物体内各种细胞功能的生物活性物质的总称，常常被应用于功能分析、抗体研究、尤其是药物研发等领域^[1]。

液相合成是基于将单个N-α保护氨基酸反复加到生长的氨基成份上，合成一步步地进行。用DCC做连接剂连接N-和C-保护氨基酸， 这种连接试剂促接N保护氨基酸自己和C保护氨基酸自由氨基间的缩水，形成肽链，同时产出副产物，而这些副反应能最小化，但是还不能完全消除。此外，此方法也可用于合成N保护氨基酸的活性酯衍生物。依次产生的活性酯将自发与任何别的C保护氨基酸或肽反应形成新的肽。

二肽(dipeptide )是最简单的肽，由一分子氨基酸的α-羧基和另一分子氨基酸的α-氨基脱水缩合形成的酰胺键(即-CO-NH-)组成的蛋白质片段或物质，其分子中仅包含一个肽键，是一大类物质的统称。

1.2 固相合成的原理

多肽合成仪以固相合成为反应原理，在密闭的防爆玻璃反应器中使氨基酸按照已知顺序不断添加、反应、合成，操作最终得到多肽载体。固相合成法，大大的减轻了每步产品提纯的难度。为了防止副反应的发生，参加反应的氨基酸的侧链都是保护的。固相合成方法有两种，即Fmoc和tBoc。由于Fmoc比tBoc存在很多优势，现在大多采用Fmoc法合成，但对于某些短肽，tBoc因其产率高的优势仍然被很多企业所采用。

具体合成由下列几个循环组成：

1） 去保护：Fmoc保护的柱子和单体必须用一种碱性溶剂去除氨基的保护基团。

2） 激活和交联：下一个氨基酸的羧基被一种活化剂所活化。活化的单体与游离的氨基反应交联，形成肽键。在此步骤使用大量的超浓度试剂驱使反应完成。循环：这两步反应反复循环直到合成完成。

3） 洗脱和脱保护：多肽从柱上洗脱下来，其保护基团被一种脱保护剂（TFA） 洗脱和脱保护。

1.3 固、液相合成的优缺点

1.3.1 固相合成的优点

(1)起始材料在固相载体上被修饰，而且反应在固相载体上通过增加溶液来进行， 在反应完成后，不想要的化合物和过量试剂被恰当的洗涤过程提纯。

(2)有时过量试剂可用来获得没有附加提纯程序的高产量。

(3)即使分子内的环化反应或多反应位点的选择性加成或选择性取代通过溶液相合成中的溶剂稀释来反应，这些反应类型在固相合成中可被无特定条件的进行，因为固相载体的反应位点保持假溶解的条件。

(4)即使在固相载体上的起始材料非常有毒也能安全地处理固相载体直到反应完成。

(5)自动化固相合成容易实现，因为简单而且易于重复反应和提纯过程。

1.3.2 固相合成的缺点：

（1)通常固相反应速率不快，因为系统是处于固相和溶液之间的异相系统。

(2)为构造反应条件，需要较溶液相反应更多的精力和时间，而后者已经发展了很多反应。

（3）由于载体和连接分子的原因，反应受到限制。

（4）识别反应中间体有些困难。

（5）通常，固相合成是不适于获得大量化合物的。

1.3.3 液相合成的优点：

(1)在溶液相合成中，可以使用先前所有的有机合成方法而没有任何的限制。

(2)反应物均一混合并且快速移动使得反应机会增加。

(3)在加热反应的例子中, 热能通过溶液中的分子分散而被均匀转移。

(4)大量反应可以通过控制反应釜的大小和反应物的数量而实现。

(5)可以在每个步骤提纯并且分析反应化合物。

1.3.4 液相合成的缺点：

(1)在反应完成之后，需要的化合物和副产物都一起在反应混合物中，需要溶液化学中的分离步骤。

(2)如果使用过量试剂以获得高产量, 需要提纯试剂。

(3)如果起始物质或副产物(或需要的化合物)易挥发或沉淀，那就容易多了，如果这些不发生，就需要一个比较困难的后处理工作-萃萃取或色谱。因此, 后处理过程通常需要更多的时间和精力胜于反应过程。

(4)自动化溶液相合成由于提纯程序的复杂化而非常困难，因而难以实现。

1.4 Fmoc保护基的优点

中文名称： Fmoc-甘氨酸

英文名称： Fmoc-Gly-OH

Fmoc-甘氨酸

纯度： ≥98%(HPLC) 等级：

分子式： C17H15NO4

分子量： 297.32

Fmoc保护基的一个主要的优点是它对酸极其稳定，在它的存在下，Boc和苄基可去保护。Fmoc的其他优点是它较易由简单的胺不通过水解来去保护，被保护的胺以游离碱释出。一般而言Fmoc对氢化稳定，但某些情况下，它可用H2/Pd-C在AcOH和MeOH仲脱去。Fmoc保护基可与酸脱去的保护基搭配而用于液相和固相的肽合^[2,3]。

1.5 氨基酸的种类及性质

1.5.1 氨基酸的种类

氨基酸是构成生物体蛋白质并同生命活动有关的最基本的物质，是在生物体内构成蛋白质分子的基本单位，与生物的生命活动有着密切的关系。它在抗体内具有特殊的生理功能，是生物体内不可缺少的营养成分之一。人体所需的氨基酸约有22种，分非必需氨基酸和必需氨基酸（须从食物中供给）。另有酸性、碱性、中性、杂环分类等。

1.5.2 氨基酸的理化性质

（1）都是无色结晶。熔点约在230 ℃以上，大多没有确切的熔点，熔融时分解并放出CO₂；都能溶于强酸和强碱溶液中，除胱氨酸、酪氨酸、二碘甲状腺素外，均溶于水；除脯氨酸和羟脯氨酸外，均难溶于乙醇和乙醚。

（2）有碱性[二元氨基一元羧酸，例如赖氨酸（lysine）]；酸性[一元氨基二元羧酸，例如谷氨酸（Glutamic acid）]；中性[一元氨基一元羧酸，例如丙氨酸（Alanine）]三种类型。大多数氨基酸都呈显不同程度的酸性或碱性，呈显中性的较少。
（3)由于其中包含有不对称的碳原子，呈旋光性，同时由于空间的排列位置不同，又有两种构型：D型和L型，而组成蛋白质的氨基酸，都属L型。蛋白质水解所得的氨基酸均为α-氨基酸，所以在生化研究方面氨基酸通常指α-氨基酸。至于β、γ、δ……ω等的氨基酸在生化研究中用途较小，大都用于有机合成、石油化工、医疗等方面。
（4）非必需氨基酸（nonessential amino acid）：指人（或其它脊椎动物）自己能由简单的前体合成，不需要从食物中获得的氨基酸。例如甘氨酸、丙氨酸等氨基酸^[4]。

1.6 核磁共振的原理及其种类

1.6.1 核磁共振的原理

由于原子核携带电荷，当原子核自旋时，会由自旋产生一个磁矩，这一磁矩的方向与原子核的自旋方向相同，大小与原子核的自旋角动量成正比。原子核进动的频率由外加磁场的强度和原子核本身的性质决定，根据量子力学原理，原子核磁矩的方向只能在这些磁量子数之间跳跃，而不能平滑的变化，这样就形成了一系列的能级。当原子核在外加磁场中接受其他来源的能量输入后，就会发生能级跃迁，这种能级跃迁是获取核磁共振信号的基础。原子核自旋的进动发生能级跃迁需要的能量通常是通过外加射频场来提供的，当外加射频场的频率与原子核自旋进动的频率相同的时候，射频场的能量才能够有效地被原子核吸收，为能级跃迁提供助力。因此某种特定的原子核，在给定的外加磁场中，只吸收某一特定频率射频场提供的能量，这样就形成了一个核磁共振信号。氢的核磁共振谱提供了三类极其有用的信息：化学位移、偶合常数、积分曲线。应用这些信息，可以推测质子在碳胳上的位置。

1.6.2 核磁共振的种类

1H的核磁共振

1H的自旋量子数是I=1/2，所以自旋磁量子数m=±1/2，即氢原子核在外磁场中应有两种取向，1H的两种取向代表了两种不同的能级，一种是高能级的核没有其它途径回到低能级即没有过剩的低能级核可以跃迁，就不会有净的吸收，NMR讯号将消失的饱和过程和通过非辐射的方式从高能态转变为低能态的弛豫过程。

13的核磁共振

天然丰富的12C的I为零，没有核磁共振信号。13C的I为1/2，有核磁共振信号。通常说的碳谱就是13C核磁共振谱。由于13C与1H的自旋量子数相同，所以13C的核磁共振原理与1H相同^【5】。

2 实验部分

2.1 仪器

冰水浴装置、减压蒸馏装置、减压过滤装置、冰水浴装置，1H-NMR使用Bruker AV400 FT-NMR核磁共振仪测定（400兆）核磁共振仪上测试；质谱在Bruker Daltonics Inc. APEXII型FT-ICR质谱仪上测试。

2.2 试剂

所有试剂均为市售分析纯，除特别说明外，未进行纯化处理。

2.3 合成过程

其中DCC是1，3－二环己基碳化二亚胺(二环己基碳二亚胺)，为白色粉末或针状晶体,不溶于一般有机溶剂。DMAP: 4-二甲氨基吡啶是一种超强亲核的酰化作用催化剂。NHS为N-羟基丁二酰亚胺是一种白色或类白色结晶粉末溶于水，易溶于丙酮、醇、乙酸乙酯，微溶于氯代烃、醚、甲苯、苯。对潮湿敏感，易结块。THF是四氢呋喃溶液作为萃取剂。DCM是二氯甲烷。

1）Fmoc-Gly-OH（10.02 g），1.1倍当量的DCC（7.649 g），1.05倍当量的NHS（4.073 g），0.01倍当量的DMAP（0.041g），THF约300 mL，冰水浴中反应几分钟后，溶液变成乳白色，有大量不溶物DCU产生。反应过夜后，过滤除去大部分的DCU。旋转浓缩至三分之二体积后，4℃放置约4小时，再过滤除去析出的DCU。继续浓缩体积，4℃放置，再过滤除去DCU。最后浓缩至30 mL左右。

2）1.2倍当量的H-Cys-OH.HCl（6.374 g），2.4倍当量的Na2CO3（8.573 g），加30 mL水，用NaOH调节溶液pH至10左右，使半胱氨酸完全溶解。冰水浴中缓慢滴加至上述THF溶液中，反应约5小时后，旋去反应体系中的THF，乙酸乙酯/盐酸水溶液反复萃取几次。有机相用无水硫酸镁干燥后，过滤旋干得到Fmoc-Gly-Cys-OH（10.36 g，收率约76.7%）。

3核磁共振图谱与质谱表征结果

ESI

ESI

结论

上述实验以甘氨酸和半胱氨酸经过一系列反应最终生成的目标产物中，通过核磁共振图谱对氢原子的位置判断以及质谱图中分子摩尔质量与甘氨酸-半胱氨酸二肽的对比，可以确定为最终产物为甘氨酸—半胱氨酸二肽，其中的产物由于形成二硫键，因而大多数产物以二聚体为主。根据此次实验结果可以用于甘氨酸-半胱氨酸二肽的合成。

参考文献

[1] 韩国成 - 几种含半胱氨酸的小分子功能肽的研究与应用[J]中南大学：应用化学，2011：3-6

剩余内容已隐藏，请支付后下载全文，论文总字数：6543字