论文总字数：31281字

摘 要

里氏木霉是生产纤维素酶的重要工业菌株，同时也是优秀的重组蛋白表达宿主。为研究里氏木霉高效表达系统及其在重组蛋白甘露聚糖酶表达中的应用，本文以里氏木霉表达水平最高的纤维二糖水解酶CBH1基因的启动子、信号肽及终止序列作为表达元件构建了甘露聚糖酶基因重组表达载体pcbh1-man5a-tcbh1，与筛选基因pyr4通过高效地电转方法，共转到里氏木霉模式菌株ku70，结果表明：转化子能在不含尿嘧啶的PDA培养基上生长并产绿色的孢子，对照组ku70菌株不能生长；PCR以及SDS-PAGE电泳结果显示甘露聚糖酶基因成功整合到里氏木霉基因组上，且转化子中有甘露聚糖酶基因定点整合到cbh1位点的菌株。虽然甘露聚糖酶的蛋白表达量较少，几乎不能观察到，但酶活测定结果显示，重组菌株的甘露聚糖酶酶活相对出发菌株ku70有显著提高；转化株在玉米浆发酵培养基中发酵144 h，重组菌株表达的甘露聚糖酶酶活约为出发菌株甘露聚糖酶酶活的3.5倍。本实验成功获得了cbh1敲除的甘露聚糖酶基因重组菌株，并且该重组菌株表达的甘露聚糖酶酶活明显高于出发菌株，这为甘露聚糖酶高产菌株的获得奠定了基础。

关键词：里氏木霉 β-甘露聚糖酶 纤维二糖水解酶

Study and application of high expression system Trichoderma reesei

Chen Xin(41111105)

Supervisor: Zhiyang Dong, Xudong Xu

Abstract

Trichoderma reesei is not only an importantly industrial strain for its ability to secrete cellulase but also an excellent host for expressing recombinant protein. In this article, a recombinant expression vector pcbh1-man5a-tcbh1, based on promoter, signal peptide and terminator sequence of gene cbh1 expressed most in Trichoderma reesei, was constructed and transformed to Trichoderma reesei strain ku70 with selection marker gene pyr4 to research on high expression system Trichoderma reesei and its application in expression of recombinant protein mannanase. It turned out that transformants could grow on PDA without uracil and produce green spores while strain ku70 couldn’t. PCR and SDS-PAGE analysis showed that gene man5a was integrated to genome of Trichoderma reesei successfully and there was strain whose gene cbh1 was replaced by gene man5a. Unfortunately, expression of man5a was low so that protein mannanase nearly couldn’t be observed. However, enzyme activity of recombinant strain was higher than that of strain ku70 according to enzyme activity measurements. When shake flask fermentation for 144h, enzyme activity of recombinant strain was 3.5-fold compared to that of strain ku70. Our work obtain cbh1-negative recombinant strain which can provide higher mannanase enzyme activity than that of strain ku70 and it lays the foundation for further study on achieving strain with high level expression of mannanase.

Keywords: Trichoderma reesei β-mannanase cellobiohydrolase

目录

中文摘要 I

Abstract II

第一章 绪论 1

1.1丝状真菌里氏木霉表达系统的研究概述 1

1.1.1 丝状真菌里氏木霉表达系统的特点 1

1.1.2丝状真菌里氏木霉表达重组蛋白研究现状 1

1.1.3提高丝状真菌里氏木霉重组蛋白表达的常用策略 1

1.2里氏木霉的遗传操作系统 2

1.2.1里氏木霉中常用的转化方法 2

1.2.2里氏木霉中常用的筛选标记 4

1.3 β-甘露聚糖酶的研究概况 5

1.3.1 β-甘露聚糖酶的定义及来源 5

1.3.2 β-甘露聚糖酶的研究现状 5

1.3.3 β-甘露聚糖酶的常用酶活测定方法 6

1.3.4 β-甘露聚糖酶的应用 6

1.4本研究的主要内容及意义 7

第二章 材料与方法 8

2.1实验材料 8

2.1.1菌株和质粒 8

2.1.2培养基及其成分 8

2.1.3主要仪器 9

2.1.4实验材料及试剂盒 9

2.1.5主要试剂及配制 10

2.1.6引物 11

2.2实验方法 12

2.2.1大肠杆菌和里氏木霉菌株的培养 12

2.2.2质粒的提取 12

2.2.3里氏木霉基因组DNA的提取 13

2.2.4琼脂糖凝胶回收DNA 14

2.2.5重组表达载体pcbh1-man5a的构建 14

2.2.6表达载体的里氏木霉转化 15

2.2.7里氏木霉转化子的筛选及鉴定 16

2.2.8里氏木霉菌株的发酵培养及表达 16

2.2.9 SDS-PADE检测胞外蛋白的表达情况 16

2.2.10甘露聚糖酶酶活的测定 17

第三章 结果与分析 19

3.1里氏木霉甘露聚糖酶基因重组表达载体pcbh1-man5a的构建 19

3.2重组表达载体的里氏木霉ku70菌株转化 20

3.3里氏木霉转化子的筛选及鉴定 21

3.4里氏木霉转化株的发酵培养及表达 23

3.5 SDS-PADE检测胞外蛋白的表达情况 24

3.6甘露聚糖酶酶活的测定 24

讨论 26

参考文献 29

致谢 33

第一章 绪论

1.1丝状真菌里氏木霉表达系统的研究概述

1.1.1 丝状真菌里氏木霉表达系统的特点

丝状真菌里氏木霉（Trichoderma reesei）是一种好氧嗜温的腐生菌种，它作为主要的木质纤维素生物质降解酶生产者，用于将可再生木质纤维素材料转化为生物能源或进行生物炼制，是工业生产中重要的纤维素酶、半纤维素酶生产菌株^[1]。作为重要的丝状真菌表达系统，它具有易于培养、胞外分泌蛋白量高、翻译的蛋白可进行修饰、良好的生物安全性、工业发酵工艺成熟以及易于对其进行操作等优点，因此，利用里氏木霉表达内源或异源酶基因在工业或者学术研究中得到了广泛的应用^[2]。此外，里氏木霉自身所产的蛋白酶量较少，使得胞外蛋白质的降解相对较少^[3]。目前，里氏木霉已成为具有重要经济价值的生产各种蛋白质的优秀丝状真菌表达系统^[4]。

1.1.2丝状真菌里氏木霉表达重组蛋白研究现状

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