mRNA选择性剪接因子PRPF8的表达与纯化

论文总字数：23103字

摘 要

mRNA前体剪接是基因表达的转录后调节中的关键步骤，能够使得具有有限基因数目的真核生物的功能性蛋白质组得到显著扩增。剪接体是剪接过程中发挥关键作用的多组分复合体，它由核内小RNA（snRNA）和核内小核糖核酸（snRNP）组合而成。前mRNA剪接加工因子8（PRPF8）是由prpf8基因编码的一种剪接体蛋白，已被证实是U2和U12依赖性剪接体的组分，并且发现其在前体mRNA剪接过程中的催化步骤II中是必需的。有证据表明PRPF8的缺失可能会导致某些类型细胞的死亡，从而导致某些疾病的发生。

本研究的主要目标是根据PRPF8的相应编码基因设计出引物后，利用cDNA作为模板对其进行PCR扩增，将扩增得到的prpf8基因片段（全长7008bp）与合适的质粒载体用同样的限制性核酸内切酶进行酶切，然后连接成重组质粒。将重组质粒转化到感受态细胞中，再挑取长出的单克隆提取质粒进行测序，从而使重组质粒得以扩增。将重组质粒转化到相应的表达细胞中可得到表达的相应蛋白，根据载体上的蛋白标记筛选出重组质粒表达的蛋白，再根据抗体的特异性结合筛选出含有PRPF8的重组蛋白。

关键词：PRPF8，剪接体，剪接，mRNA前体修饰

Abstract

Pre-mRNA splicing is a key step in the post-transcriptional regulation of gene expression, enabling significant expansion of functional proteomes of eukaryotic organisms with a limited number of genes. The spliceosome is a multi-component complex that plays a key role in the splicing process. It consists of a combination of small nuclear RNA (snRNA) and small nuclear RNP (snRNP). Pre-mRNA splicing processing factor 8 (PRPF8), a splicing protein encoded by the gene of prpf8, has been shown to be a component of the U2 and U12-dependent spliceosome and was found to be necessary in the catalytic step II during the splicing of the pre-mRNA. There is evidence that the absence of PRPF8 may lead to the death of certain types of cells, which lead to the occurrence of certain diseases.

The main objective of this study was to design primers based on the corresponding coding genes of PRPF8 and use cDNA of PRPF8 as a template to perform PCR amplification. The amplified prpf8 gene fragment (7008 bp in length) and the appropriate plasmid vector are digested with the same restriction endonuclease, and then ligated into a recombinant plasmid. The recombinant plasmid was transformed into competent cells so that the recombinant plasmid was amplified.Monoclonal cells were picked from isolated competent cells, subjected to plasmid extraction, and then sequenced.The corresponding expressed protein can be obtained by transforming the recombinant plasmid into corresponding expression cells.The expressed proteins by the recombinant plasmids were selected according to the protein markers on the vectors, and then the recombinant protein containing PRPF8 was selected according to the specific binding of the antibodies.

KEY WORDS: PRPF8, spliceosomes, splicing, pre-mRNA modification.

目录

摘要 I

Abstract II

第一章 绪论 2

1.1 背景介绍 2

1.2 研究现状 2

1.2.1 组成U5snRNP剪接体 2

1.2.2 组成U2和U12依赖性剪接体 2

1.2.3 参与U4/U6双螺旋复合物的展开 3

1.2.4 与PRPF8功能相关的疾病 3

第二章 扩增获取prpf8基因片段 4

2.1 所用试剂 4

2.2 实验方法 4

2.3 实验结果 8

2.4 讨论 9

第三章 含prpf8基因片段的重组表达载体的构建 11

3.1 所用试剂 11

3.2 实验方法 11

3.3 实验结果 16

3.4 讨论 24

小结与展望 26

致谢 28

参考文献 29

1. 绪论
   1. 背景介绍

真核生物基因含有插入序列或称内含子，它能隔开编码蛋白质的外显子，内含子的去除是通过重复组装大量高度动态的被称为剪接体的核糖核蛋白复合物而实现的，剪接体由5个小核糖核蛋白颗粒U1，U2，U4，U6和U5组成。过去10年的生物化学研究已经解释了沿着剪接体循环的不同阶段剪接复合物的组成与分离，以及它们的功能与结构分析。结构数据已证明，剪接体是蛋白质为主导的金属蛋白酶^[1]。

关于剪接体组分和其亚复合体的X射线晶体学是在已由电子显微镜观察到的完整剪接体结构的基础上构建的，这些结构为mRNA前体剪接机制的证明和解释提供了大量遗传学和生物化学数据。PRPF8是剪接体中重要的组成部分，在多种剪接体成分中均存在。

• 1. 研究现状

目前已研究出PRPF8蛋白在剪接过程中的多种重要功能，包括组成不同的剪接体、参与剪接体内部结构变化等。部分功能具体如下。

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