有丝分裂相关的酵母天然Dcn1蛋白（复合物）的富集与纯化

论文总字数：20850字

摘 要

目的：本实验主要是为了富集与纯化裂殖酵母中的天然Dcn1蛋白，并研究其与其靶蛋白的相互作用以及为Dcn1介导的真核细胞有丝分裂染色体分离忠实性的机制研究奠定基础。方法：首先提取酵母基因组，以此为模板对Dcn1基因进行PCR克隆，再对相关的基因进行双酶切，构建出p-GEX-4T-1-dcn1重组质粒载体，对其进行菌落PCR后进行测序检测。同时对裂殖酵母进行同步化细胞处理，收集不同时期的细胞产物。结论：若原实验正常进行，可以在观察pulling down的结果后，对实验数据进行分析得出Dcn1蛋白与其靶蛋白在不同细胞时期的作用关系，从而初步判断Dcn1蛋白与其靶蛋白的相互作用，并同时对Dcn1介导的真核细胞有丝分裂染色体分离忠实性的机制研究提出初步设想。实验中酵母基因组提取与克隆和表达载体的构建部分仍然让我学习到了很多实验小技巧，最后对实验过程中的操作进行分析与总结，提出改善的意见。

关键词：Dcn1蛋白，表达载体构建，菌落PCR

Abstract

The purpose of this experiment is to enrich and purify the native Dcn1 protein in fission yeast, to study its interaction with its target protein and lay a foundation for the study of the mechanism of Dcn1-mediated chromosome segregation of eukaryotic mitotic chromosomes. Methods: Firstly, the yeast genome was extracted and the Dcn1 gene was cloned as a template by PCR. The related genes were double-digested to construct a p-GEX-4T-1-dcn1 recombinant plasmid vector, which was then subjected to colony PCR. Sequencing detection. Simultaneous cell processing was performed on fission yeast to collect cell products at different times. Conclusion:If the original experiment is performed normally, after observing the result of pulling down, the experimental data can be analyzed to obtain the relationship between Dcn1 protein and its target protein in different cell phases, so as to initially determine the interaction between Dcn1 protein and its target protein, and at the same time to Dcn1 The preliminary hypothesis of the mechanisms mediated by the faithfulness of mitotic chromosome segregation in eukaryotic cells was proposed. The construction of the yeast genome extraction and cloning and expression vector in the experiment still let me learn a lot of experimental tips. At the end, I analyzed and summarized the operations during the experiment and put forward suggestions for improvement.

Keywords: Dcn1 protein, expression vector construction，colony PCR

目 录

中文摘要 ……………………………………………………………………………………Ⅰ

Abstract ……………………………………………………………………………………Ⅱ

第一章 绪论 …………………………………………………………………………1

1.1 引言 ………………………………………………………………………1

1.2 蛋白质相互作用相关研究方法概述 ………………………………………1

1.2.1 生物物理学方法………………………………………………………1

1.2.2 生物化学方法………………………………………………………2

1.3 立题依据 ……………………………………………………………………4

1.4 研究内容 ……………………………………………………………………5

第二章 实验材料与方法……………………………………………………………6

2.1 实验材料与器材 ………………………………………………………………6

2.1.1 实验主要材料……………………………………………………6

2.1.2 主要试剂或溶液…………………………………………………6

2.1.3 主要试剂配制……………………………………………………6

2.1.4 主要仪器…………………………………………………………6

2.2 实验方法………………………………………………………………………7

2.2.1 质粒 p-GEX-4T-1的转化………………………………………7

2.2.2 Dcn1的PCR扩增与纯化…………………………………………7

2.2.3 GST-Dcn1表达载体构建 …………………………………………9

第三章 实验结果与分析 ………………………………………………………12

3.1 实验结果 ………………………………………………………………12

3.1.1质粒转化结果…………………………………………………………12

3.1.2 表达载体的构建与菌落PCR……………………………………………12

3.2 实验过程中的改进 ……………………………………………………………15

3.3 实验不足………………………………………………………………………15

第四章 总结与展望 ……………………………………………………………16

致 谢 ……………………………………………………………………………17

参考文献 ……………………………………………………………………………18

第一章 绪论

1.1引言

一直以来大多科学家的梦想可以解开生命的奥秘，可以更好的造福人类。因此了解细胞分裂的详细进行状况就极为重要，但伟大的发现大多是建立在种种小发现的基础上从而总结发展，得出令人满意的结论。本论文设计就是关于有丝分裂中一种蛋白，以此为出发点来试图得出一些结论。有丝分裂中的染色体分离忠实性（或称染色体分离保真度，chromosome segregation fidelity）对于真核生物基因组的稳定性至关重要。若染色体分离异常，导致分配到子细胞的染色体数目不正常，将会使非整倍体产生^[1]；目前，世界上公认染色体非整倍体性是遗传性疾病如唐氏综合症、流产，以及肿瘤发生、发展和肿瘤抗药性的主要原因^[2]；近年研究表明，非整倍性也是导致神经退行性疾病如阿尔茨海默病、运动失调性毛细血管扩张症的内在机制之一^[1][3]。所以，研究清楚色体分离忠实性就极为重要。

剩余内容已隐藏，请支付后下载全文，论文总字数：20850字