论文总字数：36830字

摘 要

肝细胞癌是原发性肝癌中最常见的类型，具有恶性程度高、易转移、预后差等特点，在我国很大一部分肝细胞癌的发生与乙型肝炎病毒（HBV）感染相关。因此，破解HBV感染与肝细胞恶性转化之间的关系十分有必要。蛋白质组学技术的迅速发展可以帮助我们更高效地筛选与肝癌发生相关的蛋白，从而找到可能的药物靶点。

本课题依托于对转HBV编码X抗原（HBx）发展成肝癌的小鼠肝脏组织进行的蛋白质组学分析结果，磷酸化蛋白质组学数据显示，在高表达HBx的肝细胞中，存在蛋白激酶3-磷酸肌醇依赖的蛋白激酶1（PDK1）和with-no-lysine激酶（WNK1）的磷酸化水平升高，提示存在PDK1/WNK1通路的激活，而以往研究发现PDK1在维持细胞生存中起着重要作用。课题实验以体外培养的肝癌细胞系为对象，通过转染HBx基因模拟细胞感染HBV而表达HBx的状态，采用免疫印迹实验比较其与未转染细胞的PDK1/WNK1通路活化情况；为了研究PDK1/WNK1通路对细胞存活的影响，以PDK1抑制剂处理细胞后用CCK-8法检测细胞存活率，比较转染HBx的细胞与未转染细胞间的差异。结果显示，HBx表达确能使PDK1/WNK1通路激活，且可以减弱PDK1抑制剂对细胞存活的不利影响。HBx对PDK1/WNK1通路激活的促进作用可能是其表达导致肝细胞恶性转化的机制之一，研制靶向PDK1/WNK1通路的药物将为治疗HBV相关的肝细胞癌提供新思路。

关键词：肝细胞癌，蛋白质组学，乙肝病毒X抗原，PDK1/WNK1通路

Abstract

Hepatocellular carcinoma (HCC) is the most common neoplasm of the primary liver cancer, which often related to poor prognosis and bad overall survival. In china, a large group of HCC parallels that of chronic hepatitis B (HBV) virus infection, so it is necessary to define the relationship between HBV infection and tumorigenesis. Thanks to the rapid development of the technology of the proteomics, we can find drug targetable molecules more easily.

This study is mainly based on the result of a comprehensive analysis of transgenic mice liver proteome, while the mice can express Hepatitis B virus-encoded X antigen (HBx). According to the phosphoproteome result, phospho-3-phosphoinositide-dependent protein kinase-1 (p-PDK1) and phospho-with-no-lysine (K) kinase (p-WNK1) are markedly upregulated, so the PDK1/WNK1 signaling pathway shows significantly activated. And previous studies suggest that PDK1 plays a critical role in cell survival. Using Western blot analysis, this study determined the level of PDK1/WNK1 pathway activation in HBx-transgenic HCC cells in comparison with their counterpart non-transgenic HCC cells. The result shows that the upregulation of p-PDK1 and p-WNK1 in HBx-overexpressing HCC cells, which indicate that the signaling pathway is activated. Then by using a Cell Counting kit-8(CCK-8), this study examined cell viability after PDK1 inhibitor treatment and found that HBx-expression reversed the adverse effects of PDK1 inhibitor on cell viability in comparison with the control. Thus activation of the PDK1/WNK1 pathway may be one of the mechanisms whereby HBx-expression can lead to tumorigenesis, suggesting that PDK1-WNK1 signaling may serve as a potential therapeutic target in HBV-associated liver cancer.

KEY WORDS: Hepatocellular carcinoma, proteomics, Hepatitis B virus-encoded X antigen, PDK1/WNK1 signaling pathway

目录

摘要 I

Abstract II

第一章 研究背景 1

1.1 蛋白质组学技术及应用 1

1.1.1 蛋白质组研究的基本实验方法 1

1.1.2 定量蛋白质组学研究方法 1

1.1.3 磷酸化蛋白质组学研究方法 2

1.2 肝细胞癌的发病机制与治疗方法 3

1.2.1 肝细胞癌的临床分期 3

1.2.2 肝细胞癌的治疗手段 3

1.2.3 肝细胞癌诊断治疗中所面对的困难 4

1.2.4 肝细胞癌中常见的信号通路变化 5

1.2.5 肝细胞癌临床靶向治疗药物的研发 5

1.3 蛋白质组学技术在肝细胞癌分型和治疗中的应用 6

1.3.1 利用蛋白质组学技术寻找肝癌标志物 6

1.3.2 利用蛋白质组学开发肝癌治疗药物 6

1.3.3 磷酸化蛋白质组研究对攻克肝癌的意义 7

第二章 HBx通过PDK1/WNK1通路促进肝细胞癌发生的机制研究 9

2.1 HBx对肝细胞癌发生影响的研究进展 9

2.1.1 HBx的表达特点和生理作用 9

2.1.2 HBx对细胞信号通路的影响 9

2.1.3 PDK1通路对肿瘤发生的作用 9

2.2 HBx对PDK1/WNK1通路的作用研究 10

2.2.1 实验材料 10

2.2.2 实验方法 11

2.2.3 HBx在细胞系中表达对PDK1/WNK1通路的影响 12

第三章 HBx影响PDK1抑制剂作用效果的研究 13

3.1 实验材料 13

3.2 实验方法 13

3.2.1 CCK-8检测PDK1抑制剂对细胞存活率的影响 13

3.2.2 数据分析 13

3.3 PDK1抑制剂处理对细胞的影响 16

3.3.1 PDK1抑制剂处理对PDK1/WNK1通路的作用 16

3.3.2 PDK1抑制剂处理对细胞存活的影响 17

3.4 HBx对PDK1/WNK1通路和细胞存活率的作用 18

第四章 总结 23

致谢 24

参考文献 25

研究背景

有数据显示，2015年全世界因癌症死亡的人数达到约870万，比2005年增长17%，这其中因肝癌导致的死亡人数达到约80万^[1]，在癌症致死数中占比可观。在原发性肝癌中，肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma, HCC）占比超过90%^[2]，具有发生迅速、易转移复发、预后差的特点。可能加快HCC发生和进展的原因有很多，包括肝炎病毒感染、酒精滥用、代谢疾病、黄曲霉素摄入等在我国普遍存在的危险因素，因此我国是HCC的高发区，且HCC发病率还有进一步升高的趋势。因此，阐明HCC的发生和进展机制、找到更有效的诊断和治疗方法具有重要的意义和价值。

要解决肝癌难以及时诊断和治疗的问题，利用新的生物学技术手段，找到肿瘤与正常组织分子表达层面的差异十分有必要。蛋白质组学技术让我们能同时对大量的蛋白质进行定性和定量研究，获得海量的分析数据，经过正确的数据处理后可以系统全面地理解肝癌组织中发生的变化，为实现发现肝癌诊断标记物和药物靶点及临床上对病人进行更合理的分型、治疗打下基础。

蛋白质组学技术及应用

基因组研究技术的快速发展使我们可以在核酸水平上研究生物学问题，但蛋白质才是生物学功能的主要效应物，而蛋白质水平上的翻译后修饰、蛋白质相互作用等问题是用基因组和转录组无法描述的。蛋白质组在大规模水平上研究蛋白质，从而反映一个生物学系统的特征^[3]，由此我们可以在蛋白质水平上获得对细胞生命活动及疾病发生的全面理解。

蛋白质组研究的基本实验方法

蛋白质表达谱具有高度的复杂性，对样品制备要求很高。无论哪种研究方法，初始步骤都包括蛋白的提取和将蛋白质裂解成肽段，随后根据研究目的不同可能还要进行特定修饰肽段的分类和富集^[4]。

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