裂殖酵母QS调控菌丝形成的研究

论文总字数：36414字

摘 要

Abstract 2

1. 绪论 3

1 引言 3

2 QS简介 3

3 白色念珠菌 3

4 金合欢醇 4

5 其他菌QS系统 5

6 结语 5

第二章 实验材料与方法

一 实验材料 7

二 实验方法 8

第三章 实验结果

1 引物设计结果 18

2 以pFA6a-KanMX质粒为模板的DNA的PCR扩增 18

3 gsf2基因删除的PCR鉴定 19

第四章 总结 20

致谢 21

参考文献 22

摘要

群感效应（Quorum Sensing，QS）是一种依赖于细胞密度的微生物交流机制，由QS信号分子介导，可调控微生物（包括酵母）的多种生物学过程，如：生物膜形成、菌丝形成和生物发光等。真菌群感效应体系在10年前被发现，缘于法尼醇（一种QS信号分子）对致病性白假丝酵母(白色念珠菌)菌丝形成的调控作用。作为基因组序列已知的模式生物，裂殖酵母是生命科学和基础医学领域的理想研究对象，其QS调控菌丝形成的研究将对揭示致病性真菌的致病机理具有重要意义。 经过文献调研，裂殖酵母中菌丝形成的关键基因是gsf2（Systematic ID:SPCC1742.01）。我们采用同源重组技术对目标基因gsf2进行删除、构建QS缺失的酵母株（gsf2Δ），然后进行PCR鉴定。本项目通过构建酵母的QS缺失突变型gsf2Δ，以期为阐述酵母菌丝形成受到QS调控的机制研究打下基础。

关键词：gsf2；PCR，基因删除，基因构建。

Quorum Sensing is a microbial exchange mechanism depending on cell density,mediated by QS signaling molecules,regulating a variety of biological processes of the microbial,such as:biofilm formation,mycelium formation and luminescence, etc.QS system of was found in 10 years ago,due to farnesol (a QS signaling) regulation on  albicans Saccharomyces.As the model organism of genome sequence，fission yeast is an ideal subject investigated in the field of life science and  preclinical medicine,the research of  fission yeast on the formation of QS is important for the pathogenesis of pathogenic fungi.Through the literature survey,the key gene for the formation of hyphae of the fission yeast is gsf2(Systematic ID:SPCC1742.01).We use homologous recombination technology to delete the target gene gsf2 and construct the QS deletion mutant of yeast(gsf2Δ). Then we can do PCR identification.We want to expounds fission yeast on the formation of QS through constructing the QS deletion mutant of yeast.

Key words: gsf2;PCR,gene deletion,gene construction.

第一章 绪论

1 引言

群体感应又称为自动诱导，或细胞与细胞的交流[1][2]，也被称为细菌（真菌）之声交响曲，是微生物间通过化学信号分子进行信息传递的一种形式，这种信息传递一经发现就受到了人们的高度重视，因为它证明了单细胞微生物间的生命活动具有群体性，并且这种群体效应不仅存在于同种微生物细胞间，而且它同时还可以调节不同微生物间的相互关系，所以又被视为微生物语言。群体感应使得微生物能够模仿多细胞生物体，进行它们作为单细胞个体所做不到的行为并调控许多生理功能，包括毒力因子的产生、生物发光、质粒接合转移、生物膜的形成、抗生素的合成等[3][4]。从目前对群体感应系统进行研究的情况看, 它一方面有助于人们了解单细胞微生物的信息交流与行为特性的关系, 建立起化学信号物质和生理行为之间的联系, 另一方面则可通过人为地干扰或促进微生物的群体感应系统从而调控其某种功能, 以达成其在实际意义上的应用。群体感应(QS)是一种依赖于细胞密度微生物沟通机制,可以调节细菌分泌毒性因素，生物膜的形成，生物荧光等行为[5]。真菌QS系统的存在十年前被发现后,揭示了金合欢醇控制丝状形成致病性真菌多态白色念珠菌[6]。在过去的十年里，金合欢醇已被证明在白念珠菌生理扮演多个角色，作为信号分子和诱导分子对宿主细胞和其它微生物产生不利影响。除了金合欢醇，芳香醇酪醇也被发现在白念珠菌QS分子(QSM)控制增长,形态发生和生物膜的形成中有一定的作用[7]。除了酿酒酵母,另外两个芳香醇，苯乙醇和色醇在QSMs氮饥饿条件下调节形态发生被发现[8]。此外，密度依赖的行为类似于QS已经在一些其他真菌物种的描述。虽然真菌QS的研究仍处于起步阶段，它的发现改变了我们的看法，最终可能导致真菌的发展，研究出新的抗真菌药物。

2 QS简介

毒力基因的表达调控在发病机理和微生物适应宿主组织是一个至关重要的步骤，一个成功的战略调整毒力基因由许多致病细菌克服宿主的防御系统同步表达，毒力因子基于密度的功能在一个过程被称为群体感应（QS）密度[9]。微生物传播的主要机制，QS通过不断的发布和监控发生激素称为自动诱导物或群体感应分子分子（QSM）。这些分子浓度的增加而增加的生物密度，后达到一个临界值，调节响应触发领先的协同表达或抑制在整个细菌组QS相关靶基因。在上世纪60和70年代，在研究海洋弧菌菌和生物发光第一次观察到细菌在对链球菌遗传能力[10]。在那之后，QS在许多种细菌调节被大量观察，包括毒力因子的分泌，运动，生物膜的形成，产孢和抗生素生产。在病原微生物，协调本体致病因子的表达感染可能是一个显著的生存优势，加强建立感染和逃避的概率。此外，一些QSMS可以考虑按自己的致病因素，因为它们的宿主细胞有毒的可调节宿主免疫。在过去几十年，尽管细菌QS蓬勃发展,但是QS在真核生物是未知的,直到发现金合欢醇的QSM致病性真菌白色念珠菌[11]。十年以来这个开创性的研究发表,它启发了工作,引导了PubMed 的论文,“假丝酵母”和“金合欢醇”和许多其他涉及这种分子在其他生物的影响。此外，金合欢醇，其他已知的真菌QSMS是来自所有芳香醇氨基酸酪氨酸（酪），苯丙氨酸（苯乙醇）和色氨酸（醇），酪醇是第二QSM白念珠菌。1960年代，其他两个最初发现自抗生素抑制白念珠菌丝状形成，后来被发现是酿酒酵母QSMS[12]。

3 白色念珠菌

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