线虫逃避水杨酸甲酯行为的遗传学调控

论文总字数：28825字

摘 要

水杨酸甲酯是一种天然存在于多种植物体内的激素，当植物遭受到病原体的侵袭或者食草动物的攻击时，便会向外界释放出大量的水杨酸甲酯用于抵御伤害。益虫往往被水杨酸甲酯吸引，害虫则往往逃避水杨酸甲酯。但是，水杨酸甲酯影响动物行为的机制却尚不清楚。

秀丽线虫作为一种常用的模式生物，自身结构简单，生长周期短，易于培养。线虫一直以来是研究气味诱发行为的分子和神经机制的有效模型，于是我们选取秀丽线虫为对象，研究逃避水杨酸甲酯行为的遗传学调控。

之前我们的研究发现，野生型的线虫对水杨酸甲酯表现出强烈的逃避行为，然而NCA通道的相关突变体对水杨酸甲酯存在明显的逃避缺陷。线虫的NCA通道主要由NCA-1和NCA-2两个通道蛋白和UNC-80、UNC-79两个调控蛋白组成，我们对NCA通道的相关突变体进行了进一步的实验，验证了nca-1(e625)突变线虫的卷曲表型，发现其无法进行逃避实验。前期研究还发现，间隙连接的缺陷可能会影响线虫对水杨酸甲酯的逃避。为了了解NCA通道与间隙连接的作用关系，我们选取了七种间隙连接的相关突变与nca-1(e625)进行了杂交。目前得到的三种双突变品系均无法抑制nca-1(e625)的卷曲表型。我们推测，间隙连接可能和NCA通道没有直接的相互作用，其在线虫对水杨酸甲酯的逃避行为中的作用有待进一步分析。

关键词：秀丽线虫；水杨酸甲酯；逃避反应；NCA通道；

Genetic analysis of C. elegans avoidance response to methyl salicylate

Abstract

Methyl salicylate is a hormone released by a variety of plants when attacked by pathogens or herbivores to induce acquired systemic resistance, repel pests and attract beneficial insects. However, the mechanism by which methyl salicylate affects animal behavior is unclear.
         The nematode Caenorhabditis elegans is an useful model animal with short life cycle and the ability to produce large amount of progeny. C. elegans has been used for studying the molecular and neural mechanisms of various odor-induced behaviors. We use C. elegans to study the genetic mechanisms underlying the behavioral effects of methyl salicylate.
         Previous studies found that wild-type C. elegans animals exhibit a strong avoidance response to methyl salicylate. A genetic screen identified mutants of the unc-79 and unc-80 genes to be defective in the avoidance response. UNC-79 and UNC-80 are interacting subunits of the voltage-insensitive cation lead channel NCA, which is homologous to the mammalian NALCN channel. In C.elegans, two NCA channels are found, which include NCA-1 and NCA-2 with redundant functions. We verified the “coiler” phenotype of the gain-of-function nca-1(e625) mutant and found that this phenotype prohibits the examination of the avoidance behavior. Preliminary studies also suggested that defects in gap junctions can affect animals’ avoidance response to methyl salicylate. To explore the potential interaction between NCA channel and gap junction, we generated double mutants carrying nca-1(e625) and one of three gap junction mutations. Of three double mutants we generated, none had an obvious alteration of the “coiler” phenotype. We hypothesize that gap junctions might not interact strongly with NCA channels.

KEY WORDS: Caenorhabditis elegans ；Methyl salicylate ；

Avoidance response ；NCA channels ；

英文缩略词表

目 录

学位论文原创性声明 I

摘 要 II

Abstract III

英文缩略词表 IV

目 录 V

第一章 绪论 1

1.1 挥发性物质水杨酸甲酯能够影响动物的行为 1

1.1.1 植物在遭受到病虫害伤害时会产生大量的MeSa 1

1.1.2 MeSa可以提高植物对于病虫害的获得性抗性 1

1.1.3 MeSa能吸引食草动物的天敌，对虫害进行间接的抵抗 1

1.2 线虫作为研究MeSa影响动物行为的遗传学机制的模型的优势 2

1.2.1 线虫是一种重要的模式生物 2

1.2.2 线虫是研究气味改变行为的分子和神经机制的有效的模型 2

1.3 已知的研究所得的与线虫逃避反应相关的基因和通道 2

1.4 本项实验的主要研究方向及内容 3

第二章 实验仪器与耗材 4

2.1 实验仪器 4

2.2 实验耗材 5

2.3 实验试剂 5

2.4 试剂配方 6

2.4.1 M9缓冲液 6

2.4.2 线虫裂解液 6

2.4.3 液态LB培养液 7

2.4.4 TAE溶液（50×） 7

2.4.5 线虫生长培养基（NGM培养基） 7

2.4.6 NGM培养基所需溶液成分 8

2.4.7 线虫冻存液 8

2.5 线虫品系 8

第三章 实验方案与步骤 10

3.1 线虫的日常培养 10

3.1.1 制备带有食物OP50的线虫培养基 10

3.1.2 线虫的冻存 10

3.1.3 原有冻存线虫的复苏 10

3.1.4 线虫的传代培养 11

3.1.5 线虫的碱裂解和同步化 11

3.2 原有品系线虫的基因型鉴定 11

3.2.1 线虫DNA的提取 12

3.2.2 待测线虫品系突变基因片段的PCR扩增试验 12

3.2.3 琼脂糖凝胶电泳实验初步检测 12

3.2.4 送检所得PCR成品 13

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