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摘 要

Abstract: Ⅲ

第一章 绪论 1

1.1引言 1

1.2成骨细胞及其分化鉴定 1

1.2.1碱性磷酸酶染色（ALP染色） 2

1.2.2钙结节染色（Von Kossa染色） 2

1.2.3成骨分化相关基因 2

1.3 microRNA及其在成骨细胞分化过程中的作用 3

1.3.1 miRNA 3

1.3.2促进成骨分化的miRNA 3

1.3.3抑制成骨分化的miRNA 4

1.4本课题的意义 4

第二章 实验材料与实验方法 6

2.1实验材料 6

2.1.1实验用动物/细胞 6

2.1.2实验试剂 6

2.1.3实验器材 7

2.2实验方法 8

2.2.1小鼠骨髓间充质干细胞的提取与培养 8

2.2.2 miRNA转染方法 9

2.2.3靶基因预测 10

2.2.4靶基因验证 11

2.2.5 Real Time-PCR检测 13

2.2.4 ALP染色 15

2.2.5 Von Kossa染色 15

第三章 实验结果与分析 17

3.1 miR-669b-3p inhibitor最佳转染浓度筛选 17

3.2转染成功率鉴定 17

3.3靶基因预测与验证 18

3.3.1靶基因预测结果 18

3.3.2靶基因验证结果 18

3.4 ALP染色检测成骨细胞早期分化 20

3.5 Von Kossa染色检测成熟成骨细胞体外矿化能力 21

3.6定量检测成骨分化相关基因 21

结论 24

参考文献 25

致 谢 28

东南大学毕业（设计）论文独创性声明

本人声明所呈交的毕业（设计）论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得东南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。

论文作者签名： 杨亦航 日期： 2017 年 5 月 31 日

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论文作者签名： 杨亦航 导师签名：

日期： 2017 年 5 月 31 日 日期： 2017 年 5 月 31 日

英汉缩略语表

英文缩写 英文全称 中文名称

MSCs Mesenchymal stem cells 间充质干细胞

BMP2 Bone morphogenetic protein 2 骨形态发生蛋白2

OC Osteocalcin 骨钙素

OPN Osteopontin 骨桥蛋白

RUNX2 runt-related transcription factor 2 矮小相关转录因子2

DLL1 Delta-like 1 Notch配体1

ALP Alkaline phosphatase 碱性磷酸酶

DMEM Dulbecco’s modified Eagle medium 改良培养基

cDNA complementary deoxy-ribonucleic acid 互补脱氧核糖核苷酸

dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate 三磷酸脱氧核糖核苷酸

FBS fetal bovine serum 胎牛血清

PBS Phosphate buffered saline 磷酸盐缓冲液

mRNA messenger ribonucleic acid 信使RNA

miR-669对成骨细胞分化及功能的影响

41113118 杨亦航 指导老师：刘璇

摘要

骨代谢是骨骼自我更新与修复的过程，而这一过程的实质就是破骨细胞的骨吸收作用与成骨细胞的骨形成作用达成的平衡，也就是骨的吸收与重建的平衡。这一平衡遭到破坏可能导致骨代谢疾病的发生。骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)在不同的诱导条件下具有多向分化的潜能，是成骨细胞的主要来源。骨髓间充质干细胞的成骨分化是个十分复杂的过程，除了经典遗传学和表观遗传学的调控之外，近年来很多研究表明microRNA（miRNA）也在这一过程中发挥着重要的作用。本人在之前的催产素诱导成骨分化的实验中筛选出了miR-669b-3p这一特异性明显的miRNA。目前尚无miR-669b-3p与成骨分化相关的任何报道，为了探明miR-669b-3p对成骨分化及功能的具体影响，在本研究中，将miR-669b-3p inhibitor转染入小鼠骨髓间充质干细胞，预测并验证了其成骨相关靶基因是DLL1；同时，通过ALP染色检测成骨细胞早期分化水平、Von Kossa染色检测分化晚期骨钙沉积水平、RT-PCR检测成骨相关基因表达水平。结果显示转染miR-669b-3p inhibitor后MSCs早期成骨分化水平增高，分化晚期骨钙沉积增多，成骨分化相关基因——OC、OPN、BMP2、RUNX2也有显著上调，说明miR-669b-3p具有明确的成骨分化抑制功能，这可能是通过直接靶向调控DLL1，间接调控OC、OPN、BMP2、RUNX2等成骨分化相关基因实现的。本课题探明了miR-669b-3p对成骨分化的具体影响及部分作用机制，该miRNA有望成为防治骨代谢异常药物研究的新靶标。

关键词：成骨细胞，间充质干细胞，delta-like 1，miR-669b-3p

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Effects of miR-669 on osteoblast differentiation and function

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41113118 Yihang Yang Tutor: Xuan Liu

Abstract:

Bone metabolism is the process of self-renewal and repair of bone, and the essence of this process is the balance between bone resorption of osteoclasts and bone formation of osteoblasts, that is, the balance of bone absorption and reconstruction. Damage to this balance may lead to the occurrence of bone metabolic diseases. Bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) have the potential of multi-directional differentiation under different induction conditions, which is the main source of osteoblasts. The osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells is a very complicated process. In addition to classical genetics and epigenetic regulation, these years lots of studies have shown that microRNAs (miRNAs) also play an important role in this process. MiR-669b-3p was screened out in the experiment of osteogenic differentiation which induced by oxytocin. In order to investigate the specific effects of miR-669b-3p on osteogenic differentiation and function, miR-669b-3p inhibitor was transfected into the bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) ,then we predicted and verified its osteogenic related target gene is DLL1. At the same time, the early differentiation of osteoblasts was detected by alkaline phosphatase staining. The level of advanced bone calcium deposition was detected by calcium nodule staining. The expression level of osteogenic genes was detected by RT-PCR. The results showed that the level of early osteogenic differentiation of MSCs increased after transfecting miR-669b-3p inhibitor, and bone calcium deposition increased in the late osteogenesis differentiation. At the same time the genes related to osteogenic differentiation - OC, OPN, BMP2 and RUNX2 were also up-regulated, indicating that miR-669b-3p has a definite osteogenesis differentiation inhibitory function, which may be achieved by direct targeting of DLL1, indirect regulation of OC, OPN, BMP2, RUNX2 and other osteogenic differentiation related genes.This study demonstrated the specific effect of miR-669b-3p on osteogenesis differentiation and some mechanism.The miRNA is expected to be a new target for the development of drugs for the prevention and treatment of abnormal bone metabolism.

KEYWORDS: osteoblast, mesenchymal stem cells, delta-like 1, miR-669b-3p

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