冬小麦外源基因CaMV35S启动子检测分析

论文总字数：7043字

摘 要

：随着转基因技术的发展，转基因作物逐渐走向市场，而其生物安全性也受到了广泛关注，因此世界各国根据不同的作物，颁布了一系列的转基因安全检测标准，本研究根据国家发布的转基因安全检测标准，以冬小麦为实验材料，利用CTAB法抽提其基因组总DNA，分别采用普通PCR和荧光定量PCR，对待测样品中是否含有常用的启动子外源基因CaMV35s进行分子鉴定，来判断待测样品是否为转基因产品。

关键词：冬小麦，外源基因， PCR技术

Abstract: With the development of transgenic technology, transgenic crops gradually toward to the market, and the biological safety has been widespread concern, therefore, many countries depending on the crop, issued a series of transgenic safety testing standards. In this study, according to the existing GM safety inspection issued by the national standard, winter wheat as experimental material, genomic DNA of wheat products was extracted by CTAB method. we use qualitative and quantitative PCR respectively to determine whether the sample contained target gene CaMV35s.

Keywords: winter wheat, foreign gene, PCR

目录

1前言 4

2 材料与方法 4

2.1 材料 4

2.2 试剂与耗材 5

2.3 仪器设备 5

2.4 方法 5

2.4.1 DNA的提取与纯化 5

2.4.2引物和探针序列 5

2.4.3 PCR检测 6

3结果分析 8

3.1 DNA提取结果 8

3.2定性PCR检测 8

3.3荧光定量PCR检测 9

结论 11

参考文献 12

致谢 13

1前言

随着转基因产品市场的不断发展，转基因产品的安全引起世界范围内的广泛关注^[1]。转基因生物（Genetically Modified Organism, 简称GMO）是通过现代生物技术，在特定的生物体内导入目标基因片段，从而使受体生物获得某种特定性状^[2,3]。这种直接作为食品或以其为原料加工的食品称为转基因食品^[4]。转基因食品以其良好的抗逆性或高产功能等优点，能够提高人类农产品的品质，并为人类解决未来食物短缺问题提供了有效手段^[5]。

在GMO商业化进程中，创造转基因农产品的技术并不是很准确。在创造转基因农产品的操作过程当中，多个拷贝外源基因被随机地插入原有的基因组中，造成原有基因的缺失或重排^[6,7]。转基因农产品是否有毒性或致敏性，严重涉及到食品的安全、人类的健康以及生态环境的稳定等重大问题，对此我们不得不引起高度重视。

作为人类的重要谷类作物，小麦在人类食品以及动物饲料中占有重要地位^[8,9]。转基因小麦是否安全，直接影响着人类的健康，因此，对转基因小麦及其产品的检测是尤为重要。为了保障人类健康和动植物的安全，维持生态环境的稳定，应该加强对转基因农产品安全的监管，科学的对转基因农产品建立快速有效的检测方法^[10-12]，这是人类和动物维持可持续发展的重要保证。

PCR是聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)的简称^[13]。是利用核酸复制酶、引物和核酸单体组成元件，在体外完成模板DNA的复制。PCR技术有灵敏度高、快速、准确、重复性好、特异性强等优点^[14]。基于PCR方法的检测，能够判断待测样品中是否含有目的外源基因^[15]。

CaMV35s启动子是目前创造转基因农产品过程中使用最为广泛的启动子^[16]。本研究采用CTAB法抽提冬小麦基因组总DNA，通过核酸测定仪检测抽提的总DNA的浓度和纯度，将达到实验要求的基因组DNA作为模板，进行普通PCR检测，通过电泳图谱初步判断待测样品是否为转基因材料，但是由于在实验操作过程中，由操作或环境因素导致的假阳性或假阴性现象不可避免，为了进一步验证我们的待测样品，本研究进一步采用荧光实时定量 PCR对检测结果进行分析，并最终判断待测样品是否为转基因小麦。

2 材料与方法

2.1 材料

阳性质粒DNA (含有CaMV35s启动子基因）和待测样品由中国农业科学院国家检测中心提供，阴性常规冬小麦由淮阴师范学院刘乃森老师提供。

2.2 试剂与耗材

定性PCR所用Taq酶、dNTP、MgCl₂、定量PCR所用2×GoldStar TapMan Mixture(with ROX)、电泳用DNA ladder maker均由康为世纪公司提供。定性及定量PCR引物、探针均委托上海捷瑞生物工程有限公司合成。

2.3 仪器设备

普通PCR扩增仪、实时荧光PCR扩增仪、电泳槽和电泳仪等电泳装置、凝胶成像系统等。

2.4 方法

2.4.1 DNA的提取与纯化

本研究使用改进的CTAB法对小麦基因组总DNA进行抽提，实验步骤如下：
（1）将小麦颗粒使用美的搅拌机（MJ-BL25B2）粉碎成粉末状，称取0. 2 g粉末装入 2mL离心管中。
（2）立即加入600μl已经预热到65℃的2×CTAB，混合均匀。
（3）将离心管转入65℃水浴，温浴40min，温浴过程中颠倒混匀数次。
（4）加入等体积（600μl）的氯仿:异丙醇（24:1）。
（5）颠倒混匀30分钟，室温4000rpm离心20分钟。
（6）取上清（约500μl）于新的1.5ml离心管中，加入等体积（500μl）的酚:氯仿:异丙醇（25:24:1）。
（7）颠倒混匀约5分钟，常温下4000rpm离心20分钟。
（8）取上清（约400μl）于新的1.5ml离心管中，加入200μl含有RNA酶的1M NaCl溶液。
（9）加入2/3体积（400μl）已预冷的异丙醇，混匀，—20℃放置30分钟，或更长或过夜沉淀DNA。
（10）4000rpm离心10分钟，弃去上清，倒扣在吸水纸上，静置1分钟，吸干水份。
（11）加入500μl75％的乙醇清洗DNA，洗涤至少20分钟，4000rpm离心10分钟，弃上清。
（12）重复步骤11，弃上清后置于超净台吹干。
（13）用100μl的超纯水溶解DNA，—20℃储存备用。

2.4.2引物和探针序列

本研究使用的引物和探针均根据农业部发布的检测标准进行，根据发布标准，委托上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物和探针序列详见下表。

2.4.3 PCR检测

（1）定性PCR扩增

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