论文总字数：13884字

摘 要

：本论文采用一种新的工业过程操作优化方法——可视化优化方法，对利用生物表面活性剂硫酸粘杆菌素通透性处理重组大肠杆菌BL21生产海藻糖合成酶的工艺条件进行优化。结果表明：以1.40 g/L的硫酸粘杆菌素为渗透剂，35℃渗透处理72 min，即得透性化细胞海藻糖合酶，酶活是传统超声破碎法制得的2.09倍。所得透性化细胞间歇反应时，以30%麦芽糖为底物进行海藻糖转化实验，转化率可达70%，重复使用16批（12 h/批），转化率可保持在65%以上。

关 键 字：海藻糖合成酶，硫酸粘杆菌素，通透性处理，可视化优化方法

Abstract：For optimizing the technological conditions of producing trehalose synthase from E. coli BL21 after permeated by colistin sulfate, a novel visualized method for the operation of industrial process called visualized optimization method was adapted in this paper. The results indicated that a proper process was achieved with cell suspension treated by 1.40 g/L colistin sulfate for 72 min at 35℃ and the obtained enzyme activity was 2.09 times more than that of traditional methods. Utilizing the permeabilized cells for batch fermentation, the maximum conversion rate could reach 70% with 30% maltose as the substrate. The cells could be also used for at least 16 batches (12 h per batch), the conversion rate kept above 65%.

Keywords: Trehalose synthase; Colistin sulfate; Permeable treatment; Visualized optimization method

目 录

1 前言 3

1.1 海藻糖的背景 3

1.1.1 海藻糖的化学结构 3

1.1.2 海藻糖的理化作用 3

1.1.3 海藻糖的应用 3

1.2 海藻糖合成酶 4

1.3 海藻糖合成酶的提取工艺 4

1.3.1 传统提取工艺 4

1.3.2 细胞的透性化处理 4

1.4 硫酸粘杆菌素对细胞的透性化处理 5

1.5 海藻糖的测定方法 5

1.6 本课题的研究内容及意义 6

2 实验材料与方法 6

2.1 实验材料 6

2.2 实验方法 7

2.2.1 重组大肠杆菌发酵生产海藻糖合成酶 7

2.2.2 通透性大肠杆菌的制备 7

2.2.3 酶活测定 7

2.2.4 海藻糖含量的测定 7

3 结果与讨论 8

3.1 通透性处理大肠杆菌实验参数的优化 8

3.1.1 通透性试剂的最适浓度 8

3.1.2 通透性处理的最适时间 8

3.1.3 通透性处理的最适温度 9

3.2 通透性细胞海藻糖合成酶的反应工艺条件优化 10

3.2.1 设计正交实验 10

3.2.2 函数拟合结果 10

3.2.3 产生目标函数等值线 11

3.3 通透性细胞重复利用批次考察 12

结 论 14

参 考 文 献 15

致 谢 17

1 前言

1.1 海藻糖的背景

海藻糖在自然界中广泛存在于人们所食用的各类食物中，国际权威的《自然》杂志曾在2000年7月发表了对海藻糖进行评价的专文，文中指出：“对许多生命体而言，海藻糖的有与无，意味着生命或者死亡。”^[1]

1.1.1 海藻糖的化学结构

海藻糖是一种非还原性二糖，是由2分子葡萄糖以1,1-糖苷键连接而成,有3种异构体，分子式为C₁₂H₂₂O₁₁·2H₂O , 天然存在的海藻糖一般为海藻糖(α,α)型，相对分子量为378.33^[2]。

1.1.2 海藻糖的理化作用

海藻糖的化学性质极稳定,无毒无害,不会焦糖化，它是一种安全的天然多糖^[3]。

海藻糖对生物体具有保护的功能，是因为在面对极端环境的时候，会在生物体的表面形成薄膜，具有保护生物体中蛋白质防止其变性的作用。具有“生命之糖”的美誉^[4,5]。这是其他二糖所不能具备的功能。

1.1.3 海藻糖的应用

海藻糖因为具有保护蛋白质防止其失活的作用，所以海藻糖在生产生活中有很多的运用。

① 海藻糖在食品工业中的应用

因为海藻糖是一种二糖，和其他糖类一样，海藻糖可广泛应用于食品业。并且可以调节食物饮品的口味，延长保质期，使致龋性降低的作用^[6,7]。

② 海藻糖在医药工业中的应用

在医学上海藻糖作为一些需要小心保存的蛋白质类的药物的稳定剂。具有可以常温保存和干燥性好的特点，在一定程度上，可以预防艾滋病等诸多传染病的传播，已经引起了医学界的关注。

③ 海藻糖在化妆品中的应用

海藻糖在化妆品上的应用也是基于海藻糖能够在极端条件下具有保护蛋白质，防止其变性的原理，能够在细胞表层形成一层特殊的保护膜，从膜上析出的粘液不仅滋润着皮肤细胞，还具有将外来的热量辐射出去的功能。从而保护皮肤不致受损^[8,9]。

1.2 海藻糖合成酶

海藻糖合成酶是一类分子内转糖苷酶，能够使麦芽糖转化成海藻糖。具有很强的专一性质，基本上不和其他糖类发生反应。反应快速，不需要任何辅酶，容易控住，不需要磷酸盐共存。Nishimoto等人研究发现，当麦芽糖浓度在2.5%-40% 区间内变化时，海藻糖生成率没有发生改变^[10]。

海藻糖合成酶多存在于分枝杆菌、棒杆菌、假单胞菌、脂肪杆菌、丙酸菌、根瘤菌、嗜热菌和某些古细菌中。过高的温度会使以生成的海藻糖项麦芽糖方向转化，从而导致海藻糖的产量减少，所以在进行麦芽糖向海藻糖转化反应时，对温度的控制犹为重要。

目前正在研究和开发的海藻糖制备方法主要有微生物抽提法、发酵法、酶转化法。从微生物中提取海藻糖成本高，提取源有限，很大程度制约着海藻糖大规模工业化生产^[11]。发酵法转化率低，发酵液成分复杂，海藻糖的提取、精制困难，对降低生产成本、促进推广应用等方面很不利^[12]。海藻糖合成酶催化生产海藻糖，该酶反应流程短，易控制，产量高，因此该酶在海藻糖工业产业中有着光明的应用市场^[13]。所以，得到活力较高的海藻糖合酶酶活成为生产海藻糖工业的关键步骤之一，其中利用海藻糖合成酶以麦芽糖为原料的一步酶法生产海藻糖的路线由于流程清晰、调控方便等优势，成为未来工业化生产海藻糖的趋势^[14]。

1.3 海藻糖合成酶的提取工艺

1.3.1 传统提取工艺

对于海藻糖合成酶的利用，传统的方法通常先将细胞破碎，经浓缩，过滤，超滤，再浓缩等步骤逐级分离纯化后才可使用，酶活损失较大，用地大，时间久，机械损耗大，最后的产率却不高。常见细胞渗透处理方法有物理法和化学法。物理法是指利用机械的方法强行破除细胞的细胞壁和细胞膜，从而使细胞内的物质流出细胞。化学法是利用一些化学试剂通过和细胞膜上的脂质发生反应，使细胞的细胞膜结构发生改变，从而改变了通透性^[15]。

1.3.2 细胞的透性化处理

细胞透性化技术主要包括化学法、物理法和生物法。在具体的研究和应用中，应根据具体情况和应用选择合适的方法。

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