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摘 要

本课题将已筛选出的三株纤维素降解菌（NF 7-2、NF 16-7、NF 16-2）与纤维素降解能力较好的里氏木霉进行比较，在以秸秆为唯一碳源的培养基上，通过对摇瓶培养的各株菌株的不同时期的还原糖含量的测定，测定其滤纸酶活力，从而比较这三株纤维素降解菌与里氏木霉分解纤维素的能力。结果表明：三株菌中，菌株NF 16-7和NF 16-2的酶活力较低，菌株NF 7-2的活力较高，但低于里氏木霉。通过对菌株的滤纸酶活力的测定有利于对纤维素降解菌的认识，并为在工业化生产中提供理论基础。

关键词：纤维素降解菌，筛选，滤纸酶活力

Abstract: Cellulose-decomposing microorganisms degrade cellulose by secreting cellulose, which are widely used in the field of biomass energy. This aims of this study is to compare the cellulose degradation ability of Trichoderma reesei and three cellulose-decomposing microorganisms(NF 7-2, NF 16-7 and NF 16-2). Use the method of measuring the reducing sugar content of the shaking flash cultured bacteria in the different periods on the medium with straw as the sole carbon source to examine the filter paper enzyme activity. The results show that, the activity of NF 16-7 and NF 16-2 are lower, NF 7-2 is higher, all of which are lower than Trichoderma reesei. Through the survey of the filter paper enzyme activity, we have some knowledge on the cellulose degradation bacteria and this knowledge provides the fundamental basis for industrial production.

Key words: the cellulose degradation bacteria, screening, filter paper enzyme

目 录

1 前言 3

2 实验材料与预处理 4

2.1 菌种 4

2.2 培养基 4

2.2.1 固体培养基 4

2.2.2 发酵培养基 4

2.3 仪器和试剂 4

2.3.1 仪器 4

2.3.2 试剂 4

2.4 实验预处理 5

2.4.1 培养基的灭菌和预处理 5

2.4.2 试剂的配制 5

2.4.2.1 柠檬酸缓冲液的配制 5

2.4.2.2 DNS试剂的配制 5

2.4.2.3 滤纸条 5

3 实验方法 5

3.1 菌种活化 5

3.2 发酵培养基培养 5

3.3 粗酶液的制备 5

3.4 滤纸酶活测定 6

3.4.1 制备葡萄糖标准曲线 6

3.4.2 测滤纸酶活 6

3.4.3 酶活计算方法 7

3 数据分析 7

3.1 同一时间各株菌株的酶活力 7

结 论 9

参 考 文 献 10

致 谢 12

1 前言

纤维素是大分子多糖物质，其结构是不溶于水及一般有机溶剂的刚性结构^[1]。这些特征使得纤维素在常温常压、自然条件下分解地十分缓慢。从而导致纤维素的利用十分困难，造成了纤维素这一碳源的大量浪费^[1~3]。

纤维素是植物中主要的组成部分，而植被在陆地上随处可见，所以纤维素是地球上十分重要的有机物。然而，因为纤维素中有许多高能的氢键，所以很难对其进行资源化利用。我国每年农牧业生产活动中就形成了大量的农作物残渣（如秸秆），工业生产中也产生了几百万吨的纤维素废弃物。这些纤维素不但不能得到充分的利用，而且焚烧秸秆等处理废弃纤维素的措施还会污染环境^[3~9]。因此合理开发和科学利用纤维素这一天然资源是当前科学界的重要关注范围。

能够分解纤维素的微生物大量存在于自然界中，这类微生物能够分泌出专一性极强的纤维素酶，但是它们生长周期很长,同时要求严格的条件（如厌氧）来分解微生物,这些都限制了纤维素酶的应用^[10]。纤维素酶，顾名思义是降解纤维素的一组酶。降解利用纤维素的微生物主要包括细菌、真菌和放线菌，它们能够产生纤维素酶并降解纤维素转化为还原糖。纤维素酶类主要来自于微生物的分泌，在降解纤维素的过程中的作用不可忽视。这些微生物中，能够产生胞外酶的菌株是科学家们首要选择的菌株。大多数的胞外酶都是由真菌产生的，胞外酶相比于其他纤维素酶，其优点主要在于以下三点：一是其分离和提取都十分方便；二是安全无毒性；三是真菌产生的纤维素酶种类比较齐全，所以真菌是产纤维素酶工业化菌种的主要来源和首要选择。在这些真菌中，里氏木霉被广泛地应用于工业生产和资源化利用中。作为生产纤维素酶最高效的真菌，里氏木霉自然成为应用最为广泛的产纤维素酶工业菌种^[1~13]。

能够降解纤维素的真菌（如里氏木霉）中存在一系列的酶，这类酶能够降解纤维素为还原糖，主要包括β-葡萄糖苷酶（BG）、外切葡聚酶（CBH）和内切葡聚酶（EG）三种酶^[10]。其中，纤维素分解为纤维二糖是依靠外切葡聚酶和内切葡聚酶，而能够将纤维二糖分解为还原糖的是β-葡萄糖苷酶^[11~14]。在这3种酶的共同分解作用下，纤维素能够被全部消耗，转化为葡萄糖。

DNS法是在碱性条件下，还原糖能够与DNS发生一系列的反应，生成红棕色的3-氨基-5-硝基水杨酸，且生成的红棕色物质颜色的深浅与所测酶液的还原糖含量成比例^[15]。所以可以通过测定反应液的吸光值并制作葡萄糖标准曲线，然后利用公式推算出还原糖含量，确定酶活^[15,16]。这一反应过程中生成物的颜色深浅程度仅仅与样品中含有的还原基团的数量有关，也就是说与还原糖的种类无关。本实验用这一方法来测定纤维素降解菌的滤纸酶活，为纤维素酶的活性比较和筛选纤维素降解菌提供科学方法。

本实验的原理是通过比较滤纸酶活来比较三株纤维素降解菌与里氏木霉分解纤维素的能力。滤纸酶活（FPase）是指纤维素酶消耗滤纸而显示的纤维素酶总活力，反映的是所测样品中纤维素酶组分协同作用的总效果^[17]。由此可知，滤纸酶活力越高，纤维素酶总活力越高。

2 实验材料与预处理

2.1 菌种

纤维素降解菌在实验室保藏，编号分别是NF 16-2、NF 16-7、NF 7-2，标准菌株是里氏木霉。

2.2 培养基

2.2.1 固体培养基

菌种保藏斜面培养基配方（PDA）^[18]：蔗糖20 g、马铃薯200 g、琼脂15 g、水1000 ml，自然pH。

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