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摘 要

诺如病毒是食源性胃肠炎的主要病原体之一，具有高度传染性，在全球范围内均有疫情爆发。因此，对诺如病毒检测方法的建立以及优化是一个值得重视的问题。

目前，检测诺如病毒的常用方法有ELISA、免疫层析、基因芯片、RT-PCR以及电镜检测等技术。尽管这些方法曾在诺如病毒检测、疾病的诊断和研究中发挥有效的作用，但在其操作和仪器方面的选择具有很大的局限性。

本研究中采用的逆转录环介导等温扩增技术（RT-LAMP）是一种新型的可用于基因诊断的核酸检测方法。通过优化反应条件和反应体系，使得诺如病毒RT-LAMP扩增反应检测的灵敏度比常规RT-PCR高100倍。总的来说，本研究提供了一种更为快速、简单、灵敏、可靠的诺如病毒检测方法。

关键词：诺如病毒，逆转录环介导等温扩增，检测

Abstract：

Norovirus is one of the major foodborne pathogens gastroenteritis, highly contagious outbreak are on a global scale. Therefore, the establishment of norovirus detection methods and optimization is a problem worthy of attention.

At present, the common methods for detecting norovirus include ELISA, immune chromatography, gene chip, rt-pcr, and electron microscopy. Although these methods have played an effective role in the diagnosis and research of norovirus detection and disease, the selection of their operations and instruments has great limitations.

The reverse ring-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) technique used in this study is a new method of nucleic acid detection, which can be used for gene diagnosis. By optimizing the reaction conditions and reaction system, Norovirus RT-LAMP amplification assay is 100 times more sensitive than conventional RT-PCR. In summary, this study provides a faster, simpler, more sensitive, and more reliable Norovirus detection method.

Keywords：Norovirus, reverse transcription loop-mediated isothermal amplification, detection.

目 录

1 前言 5

1.1 诺如病毒的概述 5

1.1.1 发现与命名 5

1.1.2 病毒结构 5

1.1.3 基因分型 5

1.1.4 传播途径 5

1.1.5 诺如病毒流行情况 5

1.2 诺如病毒检测技术的研究现状与进展 5

1.2.1 电镜法 6

1.2.2 免疫学方法 6

1.2.3 分子生物学检测方法 6

1.2.4 基因芯片法 6

1.3 环介导等温扩增技术的研究进展 6

1.3.1 引物设计 7

1.3.2 LAMP反应原理 7

1.3.3 LAMP产物检测方法 8

1.3.4 LAMP反应特点 9

2 实验材料 9

2.1 病毒材料 9

2.2 主要试剂 9

2.3 实验仪器与厂家 9

3 实验方法 10

3.1 诺如病毒RT-LAMP引物设计与合成 10

3.2 诺如病毒RNA的提取 10

3.3 病毒RNA浓度及纯度的测定 11

3.4 诺如病毒RNA的RT-PCR反应 11

3.5 诺如病毒RNA的RT-LAMP反应体系的建立 12

3.6 比较诺如病毒RT-LAMP与RT-PCR反应灵敏度 12

4 实验结果 12

4.1 引物设计 12

4.2 病毒RNA提取结果 13

4.3 RT-LAMP反应体系的建立以及条件优化结果 13

4.4 诺如病毒RT-LAMP与RT-PCR反应检测灵敏度的比较 14

结 论 16

参考文献 18

致 谢 20

1 前言

1.1 诺如病毒的概述

1.1.1 发现与命名

1972年，一位美国学者在诺沃克镇首次检出诺如病毒，并将其命名为诺瓦克样病毒(Norwalk-like virus，NLVs)。国际病毒学命名委员会于2002年8月份正式将其命名为诺如病毒(Norovirus，No V)^[1]。

1.1.2 病毒结构

诺如病毒是一种正向单链的RNA病毒，其表面粗糙，无包膜，呈二十面体对称，球形，直径约为26~35nm，基因组全长约7.3~7.7kb。诺如病毒编码共包括3个开放阅读框架(open reading frames), 3′和5′端为非编码区，3′端拥有Poly A尾^[2]。

1.1.3 基因分型

诺如病毒可分为5个基因组(GI、GII、GIII、GIV、GV)，除了基因组GIII和GV不会感染人类，其他基因组皆可以感染人类，但检出GIV的很少，大部分都是由基因组GI和GII感染导致疫情。其中单个基因组别又能够鉴定出各种基因型^[3]。

1.1.4 传播途径

诺如病毒以受污染的食物、水和呕吐物等为媒介，能通过粪-口传播和人对人直接传播，具有高度感染性^[4]。传播速度可以与流感病毒相比较，因此被称为“胃肠性流感”^[3]。由此看来，诺如病毒检测方法的建立和优化愈加刻不容缓。

1.1.5 诺如病毒流行情况

近年来，诺如病毒感染性胃肠炎在国内许多地区的发病率都逐渐呈上升的趋势，各省普遍发生诺如病毒感染情况。而一年四季中，秋、冬季更容易感染诺如病毒，在全球范围内，有数据支持7月份是诺如病毒感染的高峰发病率^[5]。中国各地区2009—2013年门诊腹泻病例诺如病毒流行特征分析数据显示，诺如病毒感染率最高的是6~23月龄儿童和45岁以上人群，分别为13.7%和12.4%。通过诊断，引起诺如病毒感染的主要基因组为GII型，可达到89.9%^[6]。在北京地区，吴疆等^[7]调查了2006年7月~2007年3月诺如病毒感染情况，发现共有8起诺如病毒急性胃肠炎暴发疫情；在广东省，2003年-2004年有8起诺如病毒急性胃肠炎暴发疫情^[3]。

1.2 诺如病毒检测技术的研究现状与进展

自2003年以来，许多针对抗原的检测方法因其快速、低廉、操作程序简单而被广泛应用于诺如病毒抗原的检测^[8]。下面我们具体介绍一些常见的诺如病毒检测技术。

1.2.1 电镜法

电镜法可分为直接电镜法和免疫电镜法。直接电镜法灵敏度低，且检出率也较低。免疫电镜法可以应用血清捕捉抗原，然后用电子显微镜直接观察，使其检出率比直接电镜法高10~100倍^[9]。在1972年，美国学者Kapikian曾首次在美国诺瓦克镇腹泻患者的粪便中发现诺如病毒，用的就是免疫电镜方法^[10]，但是此方法对于操作者的技术和经验的要求比较高，且需要用到的仪器较为昂贵，因此无法广泛普及。

1.2.2 免疫学方法

包括酶联免疫法（ELISA）、生物素－亲和素免疫法和放射免疫法。ELISA的特异性强，可达到90.91%~96.37%，灵敏度在43.81%~97.14%^{[9, 11]}，此方法检测迅速，可以用于大规模检测；生物素－亲和素免疫法由美国创立，灵敏度比免疫电镜法高，检测简便；放射免疫法能够检测出患者体内抗体情况，但其检测时需放射性同位素作标记，因此检测周期较长（需经6d）。

1.2.3 分子生物学检测方法

刘翼等针对RNA依赖的RNA聚合酶基因区采用Koopmans引物JV12Y/JV13I建立了PT-PCR技术^[12]。广州市2003年10~12月暴发的多起集体腹泻事件，其中PT-PCR方法检测到的样本阳性率47.37%，而ELISA检测阳性率为22.37%，可以看出PT-PCR方法的灵敏度高于ELISA^[13]。其主要包括常规PT-PCR技术，多重PT-PCR技术和荧光PT-PCR技术，其中荧光PT-PCR技术的灵敏度和特异度最高，多重PT-PCR技术可以通过加入多对引物同时检测包括诺如病毒在内的多种病毒，适合大规模检测。

1.2.4 基因芯片法

基因芯片法的主要原理是将探针分子以一定的顺序和密度固定在支持物上，然后与标记的样品核酸分子杂交，通过检测和分析每个探针分子的杂交信号，获得样品分子的基因表达信息，检出率可达100拷贝/μl^[14]。史蕾等建立了一种基于磁珠的可视化基因芯片检测方法，可用于临床诺如病毒患者粪便标本检测^[15]。其特异性、灵敏度能够与普通PT-PCR方法相比较，但其检测费用相比而言更为昂贵且需要提取标本中的核酸，耗费较长时间。

1.3 环介导等温扩增技术的研究进展

环介导等温扩增技术（LAMP）是2000年由Notomi T等人研究的一种新型的分子扩增技术^[16]。该技术降低了反应和检测过程中对设备的要求，检测效率更高。该方法完成整个目的基因的扩增，只需在60~65℃的等温条件下，经过30~60分钟便可，具备敏感度高、设备简单、结果易判、特异性强、操作简单等优势。LAMP引物设计、反应原理、检测方法、反应特点如下所述：

1.3.1 引物设计

LAMP引物对应6段保守区域和4条特异性引物。6段保守区域分别是F3c、F2c、F1c、B1、B2、B3所标记的区域，4条特异性引物包括外部引物F3、B3和内部引物FIP、BIP。上游内部引物FIP由F1c区和F2区构成，下游内部引物BIP由B1c区和B2区构成。上游外部引物F3与F3区域碱基序列一致；下游外部引物B3与目的基因上的B3区域碱基序列一致。各引物具体所在位置如下图1^[16]所示。

1.3.2 LAMP反应原理

LAMP反应的开始时，在60~65℃的等温条件下，利用特异的Bst DNA聚合酶，以链置换的方式，经过30~60分钟孵育完成整个目的基因的扩增。可分为2个阶段：

第1阶段为起始模板阶段：FIP引物中的F2区与F2c区结合，在Bst DNA聚合酶作用下，由3’端向5’端延伸形成新的DNA互补链，然后，F3引物序列与模板的F3c区域结合并延伸，起始新互补链的合成，置换出由FIP引物中的F2引导的互补单链。紧接着DNA单链5’末端上的F1c与此单链末端上的F1区结合，从而形成环状结构。与此同时，下游内部引物BIP上的B2会与DNA链3’末端上的B2c互补配对，FIP引物所引导合成DNA链的互补链与BIP引物所引导合成的互补链相互置换；最后，被置换出的DNA链形成一条两端为环状的单链哑铃状结构，这种结构的DNA产物即为LAMP循环扩增反应的起始模板，如下图2^[16]所示。

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