小麦赤霉病菌拮抗内生菌的筛选及其抑菌活性评估

论文总字数：12097字

摘 要

小麦赤霉病（Wheat Head Blight，WHB）在小麦上的病发率很高，主要由禾谷镰刀菌引起，对小麦产量造成极大的经济损失。化学防治是现阶段对小麦赤霉病进行防治的有效途径。针对农药残留和抗病性日益严重的问题，需要一种新的、更安全、更有效的控制小麦赤霉病的措施。本研究从淮安不同地区采集红椒、油菜、枸杞并从中分离出内生细菌94株。根据一系列的菌落特征观察、生理生化实验及16SrDNA基因序列分析，筛选鉴定出了一株对禾谷镰刀菌有明显拮抗作用的假单胞菌Zj。结果表明，Zj菌株为革兰氏阴性菌，菌落呈淡黄色、圆形、不透明、微凸。拮抗试验表明，Zj菌株在培养皿中有明显的抑菌带(5.5mm)，在液体摇瓶中抑制率达到70%以上。更重要的是，与正常菌丝相比，菌株Zj还诱导畸形、原生质释放和分支。由此可见，假单胞菌Zj菌株可以作为一种有效的生物防治剂，对小麦赤霉病进行更可持续的管理。

关键词：小麦赤霉病，内生细菌，分离鉴定，抑菌活性

Abstract：Wheat Head Blight (WHB), caused by Fusarium graminearum, results in a serious and persistent disease problem for wheat production in China because of the high incidence. At present, chemical pesticides are an effective method for preventing and controlling this disease. Due to the growing problem of pesticide residues and disease resistance, a new, safer, and more effective measure for control of WHB is needed. In this study, 94 endophytic bacteria strains were isolated from red pepper, rape and barbarum in different areas of Huaian. Then one Pseudomonas spp. strain Zj, which has an outstanding antagonistic effect to Fusarium graminearum, was screened and identified according to a series of morphological, physiological and biochemical characteristics, as well as analysis of 16Sr DNA sequences. The results show that the strain Zj is a gram negative bacteria and its colony is pale yellow, round, opaque and slightly convex. Antagonist assay displayed that strain Zj effectively inhibit the fungus F. graminearum with an obvious bacteriostasis band (5.5 mm) in Petri dishes and 70% inhibition rate in the liquid shake flask culture. More importantly, strain Zj also induced malformation, protoplasm releases, and branches compared with the normal hypha. Thus, Pseudomonas spp. strain Zj can be further developed as an effective biocontrol agent for more sustainable management of WHB.

Keywords：Fusarium Head Blight, Endophytic bacteria, Isolation and identification, Antibacterial activity

目 录

1.1 小麦赤霉病的介绍 5

1.2 小麦赤霉病的防治 5

1.3 植物内生细菌的生防机制 5

1.4 实验目的 6

2 实验方法 6

2.1 小麦内生细菌的分离与筛选 6

2.2 内生菌的初步鉴定 7

2.3 内生拮抗菌Zj对小麦赤霉病的抑制作用研究 9

2.4 显微镜观察生防菌Zj对禾谷镰刀菌菌丝抑制程度 10

3 实验结果 10

3.1 内生细菌的分离结果 10

3.2 内生细菌的筛选结果 10

3.3 内生菌Zj的形态鉴定结果 11

3.4 内生菌Zj的生理生化鉴定结果 12

3.5 16SrDNA鉴定结果 12

3.6 皿内对峙实验结果 13

3.6 梯度摇瓶培养结果 14

3.7 离心后上清液与菌体分别抑制作用结果 15

3.8 显微镜观察生防菌Zj对禾谷镰刀菌菌丝抑制程度结果 15

结论 18

参考文献 19

致谢 20

1.1 小麦赤霉病的介绍

小麦赤霉病常发于小麦上，对单个植株会有很大危害，甚至造成单个植株绝收；而且它的发病范围非常广，甚至导致全部绝收，危害非常严重。小麦赤霉病主要由禾谷镰刀菌引起，其发生区域主要是在潮湿地区，比如长江中下游地区，近年来有往黄河流域发展的趋势，所以对小麦赤霉病的防治迫在眉睫。小麦赤霉病导致小麦产量、品质降低，更严重的是会危害到人、畜的健康^[1]。小麦赤霉病的优势种为禾谷镰孢（F.graminearum），其大型分生孢子镰刀形，有隔膜3～7个，顶端钝圆，基部足细胞明显，单个孢子无色，聚集在一起呈粉红色粘稠状^[2]。

1.2 小麦赤霉病的防治

1. 抗病育种

抗病育种所用费用低，效率高，但是周期较长。通过遗传育种培育出抗病优良品种，如2009年10月15日江苏省农科院培育成的小麦新品种生选6号，是我国审定通过的第一个高抗赤霉病的小麦新品种^[3]。

1. 药剂防治

小麦扬花期病发率高，因此药剂喷洒应选择在此期间进行。虽然目前化学防治是主要手段，对小麦赤霉病起到了重要作用。但是长期使用药剂防治会导致靶标菌产生抗药性，防治效果大大降低；并且随着人们环保意识的增加，要求化学药剂无残留，绿色环保。

1. 生物防治

因为以上防治的缺点，所以生物防治引起重视。通过大量的研究，在植物病害的综合治理中生物防治有着无法替代的重要作用^[4]。研究者们已经从不同环境下的寄生植物、非寄生植物及土壤中筛选出了拮抗菌株，包括细菌、真菌和放线菌^[5,6]。

1.3 植物内生细菌的生防机制

1. 与病原菌竞争营养物质

以相似方式进入宿主细胞的内生菌和病原体竞争营养物质和O₂，从而抑制病原菌生长^[7]。如一些内生细菌产生铁蛋白，可与铁的病原体竞争，抑制细菌生长^[7]。

1. 产生抗菌活性物质

这类物质包括抗生素类、水解酶类等。抗生素是微生物的代谢产物，具有专一性和防病稳定性，常用抗生素产量来作为筛选生防菌的重要指标^[8]。Bacillusstrians产生的脂多肽对植物根部病害有明显的抑制作用^[9]。何红等在辣椒中分离的内生枯草芽孢杆菌，可分泌环脂抗菌多肽，对番茄青枯病菌和植物炭疽病菌有很强抑制作用^[10]。水解酶类通过降解真菌细胞壁来防治病害。用于防治棉花黄萎病的内生细菌可产生抑制物抑制致病因子或蛋白酶降解毒素^[11]。

1. 诱导植物产生系统抗性

一种是通过生防细菌的群体感应信号分子AHL，细胞密度依赖方式来控制生防细菌与寄主植物间的相互作用，从而诱导防御反应^[12]。Schuhegger等^[13]发现，沙雷氏菌和恶臭假单胞菌在番茄根部进行定殖产生AHL，增强植株对叶部真菌病害的系统抗性。另一种是由细菌产生的挥发性活性物质或次生代谢物诱导防御反应。Ryu等^[14]发现，枯草芽孢杆菌和分解淀粉芽孢杆菌释放的挥发性有机化合物刺激拟南芥的防御反应，促进植物生长。

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