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摘 要

本研究由热带假丝酵母中克隆β-葡萄糖苷酶基因，该基因序列长度约为2500 bp，通过氨基酸序列分析知道其蛋白分子量大小98kDa左右，等电点pI为5.03。构建重组表达质粒pET28a-bgl2转化入大肠杆菌进行异源表达，并对重组酶的酶学性质进行了研究。主要结论：重组β-葡萄糖苷酶bgl2的最适温度为40℃，当温度升到50℃时，活力下降较快，最适pH为6.5，在此条件下保温3h后还能剩余60%以上的酶活力。大多数的低浓度金属离子对bgl2都有不同程度的激活作用，高浓度可能会减少促进作用甚至起到抑制作用，其中Fe³ 的激活作用最大；不同浓度的Cu² 和Mn² 均有抑制作用。

关键词：β-葡萄糖苷酶，基因克隆表达，酶学性质

Abstract: In this study, the β-glucosidase gene was cloned from Candida tropicalis. The sequence length of β-glucosidase gene was about 2500 bp,. The protein molecular weight of β-glucosidase gene was about 98kDa by amino acid sequence analysis, and the isoelectric point pI was 5.03. The recombinant expression plasmid pET28a-bgl2 was transformed into E. coli for heterogenous expression, and the enzymatic properties of the recombinant enzyme were studied. Conclusion: the optimum temperature of recombinant β-glucosidase bgl2 is 40 ℃. When the temperature rises to 50 ℃, the activity of recombinant β-glucosidase pH decreases rapidly, and the optimum temperature of recombinant β-glucosidase is 6.5. Under these conditions, more than 60% of the enzyme activity can be retained after 3 hours of heat preservation. Most of the low concentrations of metal ions have different degrees of activation of bgl2. High concentrations of metal ions may reduce the promoting effect or even inhibit the activation of Fe³ , and different concentrations of Cu² and Mn² have inhibitory effect.

Keywords：β-glucosidase，gene cloning and expression，enzymatic properties

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目 录

1 前言 4

1.1β-葡萄糖苷酶的性质 4

1.2β-葡萄糖苷酶的来源 4

1.3β-葡萄糖苷酶的研究进展 4

1.4β-葡萄糖苷酶的应用 4

1.5研究的目的及意义 5

2材料与方法 6

2.1材料 6

2.2方法 7

3结果与分析 9

3.1β-葡萄糖苷酶bgl2基因的克隆 9

3.2β-葡萄糖苷酶bgl2在大肠杆菌中的异源表达 10

3.3β-葡萄糖苷酶bgl2的酶学性质的研究 11

结 论 15

参 考 文 献 16

致谢 18

1 前言

β-葡萄糖苷酶也叫纤维二糖酶，又称β-D-葡萄糖苷水解酶，是纤维素分解酶系中的重要组成成分^[1]，并且它能直接将纤维素二糖水解为葡萄糖，是该酶系中的限速步骤^[2]。

1.1 β-葡萄糖苷酶的性质

β-葡萄糖苷酶可以水解结合于末端的非还原性的糖苷键^[3]，并释放出配基和游离的葡萄糖体^[4]。不同来源的β-葡萄糖苷酶的分子量大小也不同，不管是同一菌属还是植物同一组织的都是如此，最小只有几十KDa,最大可能达到几百KDa^[5]。目前所报道的β-葡萄糖苷酶大多数为酸性蛋白酶，最适pH一般在3.0-7.0范围内，最适反应温度跨度较大，一般在40-110℃范围内^[6]。

1.2 β-葡萄糖苷酶的来源

和 等1837年在苦杏仁汁中第一次发现了β-葡萄糖苷酶^[6]。经过众多科学家的研究发现，β-葡萄糖苷酶广泛存在于自然界的植物、动物和微生物中^[6]。植物来源有大豆^[8]、人参等；动物来源包括蜜蜂、猪小肠^[7]等；目前报道最多的来源是微生物，包括原核微生物约式黄杆菌、脑膜脓毒性黄杆菌^[9]，真核微生物、黑曲霉等。

1.3 β-葡萄糖苷酶的研究进展

自从1837年从苦杏汁中发现β-葡萄糖苷酶，人们对于β-葡萄糖苷酶的研究越来越多，也越来越深入。1989年等首次将β-葡萄糖苷酶基因克隆出来并有效表达^[10]。随着各种技术的发展，据报道，已经有多种芽孢杆菌和大肠杆菌能够高效表达β-葡萄糖苷酶了，并且酶活能够高于野生型菌株的几十倍或者几百倍^[11]。

β-葡萄糖苷酶的来源广泛，包括微生物、植物、动物，微生物中β-葡萄糖苷酶产量最高的菌种是黑曲霉^[12]。目前，研究β-葡萄糖苷酶的目的已经不仅仅局限于提取，而是对该酶的克隆表达及发酵条件的优化进行研究，新构建的优良工程菌已经能够投入到生产中去了 。

1.4 β-葡萄糖苷酶的应用

1.4.1 作为风味增香剂的应用

人们在研究水果风味时发现水果中普遍存在一种前体，如糖苷等物质，而β-葡萄糖苷酶能够水解这些前体，从而释放出水果中以键合态存在的香气组分，即挥发性的糖苷配基，能够使香气中醇系香气物质含量增多，然后增加茶叶^[13]、果汁、果酒等的香气^[14]。因此β-葡萄糖苷酶作为水果风味增香酶最合适。

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