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摘 要

本论文针对实验保存的3种可产环糊精葡萄糖基转移酶（CGTase）的菌株，首先通过平板筛选与摇瓶发酵测定，挑选出了高产CGTase的一株菌株。再采用单因素摇瓶发酵实验，考察不同碳源、氮源对菌株产CGTase的影响。最后运用Plackett-Burman设计和响应面分析法进一步优化，得到最佳发酵培养基组成。实验结果表明，该菌株高产CGTase的最优发酵培养基成分及最佳浓度分别为玉米淀粉18.9g/L，蛋白胨5g/L，牛肉膏5g/L，NH₄NO₃16.2g/L，K₂HPO₄ 1g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2g/L，Na₂CO₃5g/L。

关键词：环糊精葡萄糖基转移酶，发酵条件优化，响应面分析法

Abstract：In this study, a strain called BC30-1-2 which can produce Cyclodextrin Glucanotransferase was derived by the method of plate screening and shaking flask fermentation. By the method of single factor experiment, optimized fermentation conditions to obtain the best carbon source and nitrogen source on production CGTase. Plackett-Burman design was undertaken to evaluate the effect of main factors related to the influence of CGTase production. Response surface experiments designed by Box-Behenken were conducted to study the optimum conditions for production have been found to be that:corn starch18.9g/L, peptone5g/L, beef extract5g/L, NH₄NO₃16.2g/L, K₂HPO₄1g/L, MgSO₄·7H₂O0.2g/L, Na₂CO₃5g/L.

Keywords：cyclodextrin glucosyltransferase, fermentation conditions optimization, response surface methodology

目 录

1 前言 3

2 材料与方法 4

2.1 材料 4

2.1.1 实验菌株 5

2.1.2 培养基 5

2.1.3 设备与试剂 5

2.2 方法 5

2.2.1 菌株培养 5

2.2.2 粗酶液的制备 6

2.2.3粗酶液酶活的测定 6

2.3 发酵培养基优化 7

2.3.1 菌株产CGTase的碳源优化 7

2.3.2 菌株产CGTase的有机氮源优化 7

2.3.3 菌株产CGTase的无机氮源优化 7

2.3.4 Plackett-Burman实验 7

2.3.5 响应面实验 7

3 结果与分析 8

3.1 菌株筛选 8

3.2 菌株产CGTase的发酵条件的优化 9

3.2.1 不同碳源对菌株产酶的影响 9

3.2.2 不同有机氮源对菌株产酶的影响 9

3.2.3 不同无机氮源对菌株产酶的影响 10

3.3 Plackett-Burman实验 11

3.4 响应面分析 12

结 论 17

参考文献 18

致 谢 19

1 前言

环糊精的研究历史已有一百二十多年，随着对环糊精性质与结构^[1]的深入了解，人们对环糊精及其衍生物在不同领域中的应用进行了全方面的研究。环糊精最先是由Villiers发现的，是从Bacillus amylobacter的淀粉消化液中分离出来的物质。人们根据其连接的葡萄糖基数不同将其分别称为α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精等^[2]。这些环糊精都具有共同的结构与性质，其中具有重要作用的是环糊精的包埋作用。环糊精可以包埋亲水性以及合适尺寸的分子，因为环糊精内侧具有疏水性，可以形成疏水空腔。通过分子间的相互作用，将分子包埋起来，所包合物的具有较强稳定性。1932年，Pringshem首次提出这一性质，随后Freudenberg等人研究合成出54种环糊精与有机分子的主客体包合物。正是这一性质的提出以及对其的深入研究发现，α-环糊精可与甲基橙形成包合物^[3]并且能利用分光光度计法来定量测量α环糊精。同样，β-环糊精可用酚酞法^[4]测定，γ-环糊精可用溴甲酚绿法^[5]定量测定。它们的吸收波长分别为507nm、550nm、640nm。

近年来，人们对知识的探索与研究日益增加，不再局限于单一学科的研究，而是致力于将不同的知识技术结合起来开发新事物，这使环糊精及其修饰物和衍生物的应用越来越广泛。现如今，环糊精的应用已深入到人们生活的方方面面，无一不具有重要作用。例如环糊精在食品方面的应用如香料、去污剂、防腐包装等，在日用品方面如化妆品调香，环境方面如环境监测、有害物质分离等，在农业上如小麦的增产效应、植物生产素、饲料以及在药物配置上等具有重要作用。此外环糊精衍生物如甲基环糊精，其包合油溶性分子的能力特别强，具有低吸湿性和高表面活性特征，主要应用于在食品、制药方面；羟丙基环糊精可增加药物的溶解度，降低毒副作用，主要应用于医药领域。有些环糊精衍生物还可用作水凝胶材料^[6]，有些衍生物在超分子化学中、分析化学中等方面也有许多成就。但这些应用的产生需要大量的环糊精为基础，这就引起了人们对于环糊精生产过程的研究。

环糊精是由淀粉经环糊精葡萄糖基转移酶（CGTase）作用下产生的一系列环状低聚糖的总称。环糊精大多是采用生物酶法制备的即通过自然界中微生物发酵产生的CGTase来分解淀粉、糖原等葡萄糖聚合物来制得。CGTase具有蛋白质一级结构、结构域及活性中心，其催化的反应有四种，并且不同的CGTase经改造可能具有各自的专一性产物^[7]，这对环糊精的研究具有很大的帮助。CGTase的来源菌种有很多种，且随着研究的不断深入，人们从自然界分离出的菌株也越来越多，例如环化芽孢杆菌（B.circulars）、地衣芽孢杆菌（B.lichenrmis）、肺炎克雷伯菌、假单孢菌等，在工业中常采用需氧嗜温菌、需氧嗜盐菌、厌氧嗜热菌等。大部分菌种发酵所分泌的CGTase为胞外酶。当然不同来源的CGTase的酶学性质也不同，比如分子量、最适pH、等电点等存在差异，这对环糊精的生产研究具有科学的指导意义。

CGTase亦可成称为环状淀粉转移酶，其具有一定的催化机制，与自身的蛋白质结构紧密相连，其残基对CGTase的催化活性也具有一定的影响。此外，CGTase具有产物专一性，但还存在许多未知的疑问。环糊精葡萄糖基转移酶是淀粉水解类酶，不同的酶类在氨基酸序列上具有相似性，但也有各自的特殊之处，比如结构域与活性中心各不相同。它的催化机理分为两种：构象反转型和构象保持型。CGTase催化淀粉水解的能力可用酶活来衡量。酶活表示酶催化某一反应的能力。酶活是评价一个产酶菌体的重要指标，CGTase的酶活则通过显色法再测定其吸光度来计算，即1个酶活单位定义为上述条件下吸光度降低10%的酶量。酶活大小代表着菌体的产酶能力以及酶的催化能力，而菌体在发酵过程中产酶又受到其培养基成分及温度、pH等因素的影响。

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