论文总字数：10867字

摘 要

本实验以Rio2基因沉默的0313-19号水稻种子和日本晴水稻种子为材料，比较两种水稻幼苗地下部分在100mmol/L盐浓度下的生长情况，通过此实验来探究Rio2基因是否通过调控核糖体的生物合成从而影响盐胁迫下转基因水稻幼苗地下部分的生长，Rio2基因是否与盐胁迫有关。实验结果表明，在盐胁迫处理下两种水稻幼苗地下部分的生长都受到抑制。随着盐胁迫处理时间的延长， Rio2基因沉默的水稻幼苗和日本晴水稻幼苗的根长都有所下降，植株矮小，根部稀疏细长。Rio2基因沉默的水稻幼苗根系的SOD活性与POD活性与对照相比是先升高后下降。超氧阴离子自由基含量升高，与对照相比没有明显的差异。

关键词：盐胁迫；Rio2基因；水稻

Abstract: This experiment by Rio2 gene silencing of 0313-19 rice seeds and Japan fine rice seeds as the material, comparing two rice seedling underground part tendency in 100 L the growth condition of salt concentration, through the experiment to investigate whether Rio2 genes through regulating the ribosome biosynthesis thus affecting transgenic rice seedlings under salt stress the growth of the underground part, Rio2 gene is related to salt stress. The results showed that the growth of both rice seedlings was inhibited under salt stress. With the extension of salt stress treatment time, the root length of rice seedlings with Rio2 gene silencing and Japanese sunny rice seedlings decreased, and the plants were small with sparse and slender roots. Compared with the control group, the SOD activity and POD activity of rice seedling roots with Rio2 gene silencing first increased and then decreased. The content of superoxide anion radical increased, and there was no significant difference compared with the control group.

Key words: salt stress,;Rio2 gene ;,rice;

目录

1 引言 3

1.1 盐胁迫对植物生理代谢方面的影响 3

1.2 水稻的耐盐性 4

1.3 盐胁迫对植物活性氧代谢及抗氧化系统方面的影响 4

1.4 RIO蛋白激酶概述 4

2 材料与方法 5

2.1 组织培养基的配方 5

2.2 霍兰格营养液的配方 5

2.3 水稻材料的培养 6

2.4 实验设计 6

2.5 根长的测定 6

2.6 生理指标的测定方法 7

2.6.1超氧化物歧化酶SOD活性测定（氮蓝四唑光化还原法） 7

2.6.2过氧化物酶POD活性的测定（愈创木酚法） 8

2.6.3氧阴离子自由基（O₂）产生速率的测定（羟胺氧化法） 8

2.7 实验数据处理 9

3 结果分析 9

3.1 盐胁迫对水稻幼苗根长的影响 9

3.2 盐胁迫下水稻幼苗根部SOD 活性的变化 11

3.3 盐胁迫下水稻幼苗根部POD 活性的变化 13

3.4 盐胁迫下水稻幼苗根部超氧阴离子自由基含量的变化 14

结论 15

致 谢 17

引言

土地盐碱化是目前世界上存在的比较严重的环境问题之一，特别是在中国西北地区最为严重。我国的盐碱土面积约为l.0x10⁸公顷，其中现代盐碱土约占37%，残积盐碱土约占45%.潜在盐碱土约占18%^[1]。土地盐碱化对我国种植业和畜牧业的发展造成了严重的威胁 ^[2]，据内蒙河套平原的统计数据，在盐碱化地区每年由很多农作物因为盐碱胁迫而严重影响收成，而重度盐碱化土壤则几乎没有收成^[3]。水稻属于不耐盐植物，土壤盐碱化的影响很大程度上影响了其产量，为了克服这一难题，对水稻对盐的耐受性的研究和品种的改良成为了一项关键的课题。提高水稻的耐盐性的主要方法是培育改良耐盐性较强的转基因品种，而为了很好的快速实现这一目标，基因工程技术成为了一项强有力的手段。培育耐盐性强的水稻品种，开展深入对水稻盐耐受性的研究，通过遗传改良水稻的耐盐性，以至培育出耐盐性强的水稻品种。科学家为了提高水稻的耐盐性，对水稻在盐胁迫下的生理特性和遗传机制进行了大量研究，但研究进程缓慢^[4]，至今没有培育出真正意义上的耐盐品种。而植物的遗传性转能通过转基因技术进行改变，不同品种之间的生殖隔离被外源基因的导入打破，一个物种的基因资源因此丰富，也可以弥补常规育种无法快速达到的育种目的，使作物育种得到了快速的发展^[5]。

盐胁迫对水稻生理代谢方面的影响

水稻在盐胁迫环境下，不同的品种会表现出不同程度的耐盐胁迫能力，不过普遍会表现出叶片焦黄、无分蘖发生、植株矮小瘦弱、根系稀疏瘦长等受伤害症状，严重时会导致植株死亡^[6]。水稻植株对盐胁迫的敏感度和耐受能力是挑选和培育耐盐性品种水稻的基础。

由于盐胁迫环境会使细胞内的水势高于细胞外水势，导致细胞内的水流向细胞外而导致细胞失水皱缩，从而使水稻植株在形态上表现出失水干旱状态 ^[7]。盐胁迫会干扰植株细胞内特殊的电子传递链从而影响细胞内正常的活性氧代谢，细胞正常的生理代谢功能会受到破坏。

水稻的耐盐性

水稻耐盐性指的是，在盐胁迫环境下，水稻植株细胞中产生的活性氧的迫害能够通过一系列复杂的抗氧化系统得到缓解，从而能抵御盐胁迫环境。不同品种的水稻对盐害环境的耐受程度也不相同，水稻种质在这方面存在差异，与其遗传背景有着密不可分的联系。科学家通过对水稻耐盐性的生理特性、遗传克隆、转基因育种等一系列的研究，为进一步深入对水稻耐盐性的研究提供了参考。

盐胁迫对植物活性氧代谢及抗氧化系统方面的影响

在盐胁迫环境下，水稻植株的抗氧化系统需要清除一系列的活性氧，O2·-和H2O2是两种关键的活性氧（ROS），其能够引起细胞膜脂过氧化，从而使植物体受伤甚至死亡。在长期的进化过程中，植物也相应形成了酶促和非酶促两大活性氧清除系统。其中，超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶等是植物体内活性氧代谢的重要酶类，可在一定程度上减缓或抵御逆境对植物的伤害[8]。超氧化物歧化酶是植物体内活性氧清除的第一道防线，可以催化发生歧化反应生成 H2O2和 O2，过氧化物酶在清除 H2O2过程中发挥重要作用。当植物处于盐胁迫下，随活性氧的增加，叶片中上述三种酶的活性均呈先升高又降低的趋势，说明盐胁迫下植株体内的抗氧化能力增强，以及时清除过量的活性氧，降低对细胞膜系统的伤害，以降低对植物体的伤害。

RIO蛋白激酶概述

RIO家族是一个近几年才被发现的非典型激酶家族^[9]， RIO1、RIO2、RIO3三个成员构成了非典型蛋白激酶激酶家族。其中RIO1和RIO2出现于从古菌到人体的各种有机体内^[10]。RIO2包含一个保守的RIO激酶结构域，包含ß3、ac、p环、铰链区（Hinge）、金属离子结合环、催化区、aI等亚结构必须的保守残基。一个N-臂和C-臂组成Rio2的空间结构，同时可变环的亚结构域存在于在N-臂和C-臂之间。Rio2存在于从古菌到人的各种生物体内，其可变环由18个残基组成。Rio2与相关蛋白的合成有着密切联系，Rio2为20S前体rRNA剪切为18SrRNA必需的。

水稻的耐盐性研究对转基因耐盐品种水稻育种有着重要的科学意义，本实验研究水稻Rio2基因的沉默能否影响盐胁迫下转Rio2基因水稻幼苗地下部分的生长。本实验通过对Rio2基因沉默的水稻在100mmol/LNaCl浓度下生长情况的观察，以及通过测定水稻幼苗根部SOD活性、POD活性和超氧阴离子自由基含量，探讨Rio2基因是否与水稻耐盐性相关。

材料与方法

组织培养基的配方

表1：组织培养基的配方

	1L	1.5L	2L
MS培养基（PH5.8）	20.87g	31.305g	41.74g
NAA（0.2mg/mL）	5mL	7.5mL	10mL
多效唑（15%可湿性粉剂）（1mg/mL）	6mL	9mL	12mL
蔗糖	15g	22.5g	30g
琼脂（可以加到7g/L）	1.5g	2.25g	3g

按上述配方配置好培养基后，将PH值调至5.8，每400mL培养基 400μL（50mg/mL潮霉素）。

霍兰格营养液的配方

表2：霍兰格营养液的配方^[11]

	组分	含量（mg/L）
大量Ⅰ	CaNO3·4H2O	945
大量Ⅱ	KNO3	506
	NH4NO3	80
	KH2PO4	136
	MgSO4	493
微量Ⅰ	CuSO4·5H2O	0.025
	CoCl2	0.025
微量Ⅱ	NaMoO4·2H2O	0.25
微量Ⅲ	KI	0.83
	H3BO3	6.2
	MnSO4·H2O	22.3
	ZnSO4·H2O	8.6
铁盐	FeSO4·7H2O	13.9
	CaNO3·4H2O	945

按照上表的配方配制霍兰格营养液，储存在干净的水桶中，作为定期更换的营养液。

水稻材料的培养

选用Rio2基因沉默的0313-19号水稻种子和日本晴水稻种子。本研究所用的Rio2基因沉默的0313-19号水稻种子是采用RNA干扰技术得到的。

挑选大小相似、饱满并发育良好的种子，清洗干净后放入水中浸泡，然后剥壳备用。首先将剥了壳的种子放入10mL的离心管内，用70%乙醇进行1min的灭菌，再用安替福民与蒸馏水1：1.5比例配制的溶液外加1~3滴吐温20，每管约5mL，不时摇动，消毒约40min，再用无菌水冲洗4~5次，并用灭菌纸吸干种子上的液体，最后将水稻种子接种在试管底部的培养基上，每管3粒。将试管整齐置于试管架上，放入培养温度为26℃左右的培养箱中催芽。

在发芽一周左右时，挑选长至约6厘米左右的Rio2基因沉默的0313-19号水稻幼苗和日本晴水稻幼苗各60株，将水稻幼苗的根部用海绵包住，并移入均匀打孔的泡沫板孔中，使水稻幼苗能在泡沫板上直立，接着置于装有2.5L霍格兰营养液的蓝色塑料盒中培养^[12]。将盒子置于培养温度为±25℃、湿度约为75%的培养箱中进行培养。每隔三天更换一次培养液。更换培养液时要测定好培养液的PH值在合适范围内，PH值为5.0~6.0。

实验设计

待水稻幼苗在新环境中适应生长3天后，对两种水稻幼苗进行如下处理：对照（日本晴水稻幼苗）、对照（日本晴水稻幼苗） 100mM NaCl、Rio2基因沉默的0313-19号水稻幼苗、Rio2基因沉默的0313-19号水稻幼苗 100mM NaCl共四组处理。每隔三天更换一次营养液，并在盐处理组加入相同量的Nacl，Nacl浓度保持100mmol/L。在盐胁迫处理后0d、1d、4d、7d、10d、13d，在每个处理中随机取样，测定水稻幼苗根系的长度，根系SOD活性、根系POD活性和超氧阴离子自由基含量。每个处理重复3次。

根长的测定

分别在盐胁迫处理后0d、1d、4d、7d、10d、13d，用直尺测量各组待测水稻幼苗的根长， 记录并处理每个处理组水稻幼苗根长的平均值，即为此处理组水稻幼苗根长的平均值^[13]。

生理指标的测定方法

超氧化物歧化酶SOD活性测定（氮蓝四唑光化还原法）

将准备好的试管洗干净并放入烘箱中烘干，在每支试管上做好标记。接着配制好实验所需要的试剂，然后在预冷的研钵中将0.1g水稻幼苗根部样品充分研磨成匀浆作为酶液。用移液枪吸取3mL SOD反应液加入到试管中，再加入30μL酶液，混合摇匀；接着准备一试管加入3.03ml（0.05mol/L）磷酸缓冲液，放入黑暗中20min，此管作对照调零管；再另取一支试管用移液枪吸取3mL SOD反应液加入到试管中，再加入30μL磷酸缓冲液，将此支试管作为最大还原管。将最大还原管和加入酶液的试管进行照光处理，调零避光条件下测OD₅₆₀。最后计算酶活性，计算酶活性的具体方法参照李合生^[14]

过氧化物酶POD活性的测定（愈创木酚法）

配置好实验所需要的试剂和酶液，取一支试管用移液枪加入3.03ml（0.2mol/L）磷酸缓冲液，将其作为对照调零管。用移液枪吸取3mL POD反应液加入到标记好的试管中，再加入30μL酶液，接着测定OD₄₇₀值，间隔40s测定一次，反复测量三次。最后计算酶活性，计算酶活性的具体方法参照李合生^[14]

超氧阴离子自由基（O₂）产生速率的测定（羟胺氧化法）

配置好实验所需要的试剂和酶液，用移液枪吸取 0.25mL 的0.05mol/L磷酸缓冲溶液加入到标记好的试管中，再加入0.25mL 的1mmol/L的盐酸羟胺溶液，再加入0.25mL酶液，混合摇匀，然后将试管放入25℃的恒温箱中反应一小时后加入0.5mL的17mmol/L对氨基苯磺酸和0.5ml的α-萘胺溶液，混合均匀后再将试管放在25℃的恒温箱中反应20min；用清水作为对照进行调零，将试管中的溶液倒入事先标记好的离心管中离心，取粉红色液相测定OD₅₃₀。最后计算超氧阴离子自由基产生速率，计算方法参照李合生^[14]。

实验数据处理

用Excel 2010和SPSS 16.0软件对实验数据进行整理、统计，并进行差异性分析。

结果分析

盐胁迫对Rio2基因沉默的水稻幼苗根长的影响

用100mM NaCl盐胁迫处理 Rio2基因沉默的0313-19号水稻幼苗和日本晴水稻幼苗，分别在盐胁迫处理0d、1d、4d、7d、10d、13d后取样，用直尺对根长进行测量并取平均值，并在盐胁迫处理13d后拍照记录，结果见图1、图2。

由图1可知,在未加盐处理下的两种水稻幼苗生长情况较好，在100mmol/L盐胁迫处理下的两种水稻幼苗则在形态上呈现相似的受损状态，基本表现为叶片萎蔫、叶缘焦枯，地下部分发育不良，这说明盐胁迫会抑制水稻幼苗的生长。未加盐处理下的对照水稻幼苗和Rio2基因沉默的0313-19号水稻幼苗的根部长势相近，而在盐胁迫处理下， Rio2基因沉默的0313-19水稻幼苗的根部长度比对照水稻幼苗要长一些。

由图2可知，水稻幼苗根部生长趋势都是先生长迅速，然后再趋于平缓。对照水稻幼苗根部与Rio2基因沉默的0313-19号水稻幼苗根部在未加盐处理下生长情况相似。对照水稻幼苗根部生长在未加盐胁迫处理与盐胁迫处理下的生长差异非常显著（P=0.004lt;0.01）； Rio2基因沉默的0313-19号水稻幼苗根部在未加盐胁迫处理与盐胁迫处理下生长差异显著（P=0.038lt;0.05）。这说明盐胁迫对转基因水稻幼苗根部的生长有着抑制作用。

盐胁迫下水稻幼苗根部SOD 活性的变化

用100mM NaCl对Rio2基因沉默的0313-19号水稻幼苗和日本晴水稻幼苗进行盐胁迫处理。在盐胁迫处理0d、1d、4d、7d、10d、13d后进行随机取样，测定两种水稻幼苗根部的超氧化物歧化酶活性，结果见图3。

由图3可知，随着盐胁迫处理时间延长，盐胁迫处理的对照水稻幼苗根部SOD活性大于未加盐处理的对照水稻幼苗根部SOD活性。通过SPSS数据分析得出，差异显著（P=0.044lt;0.5）。盐胁迫处理的Rio2基因沉默的0313-19号水稻幼苗根部的SOD活性一直高于未加盐处理的Rio2基因沉默的0313-19号水稻幼苗根部的SOD活性，通过SPSS数据分析得出，差异显著（P=0.147lt;0.5）。由此可以得出，水稻幼苗根部SOD活性受到盐胁迫的影响较大。由图3可知，随着盐胁迫处理时间的延长，Rio2基因沉默的0313-19号水稻幼苗根部SOD活性小于对照水稻幼苗根部SOD活性，通过SPSS数据分析得出，差异不显著（P=0.218gt;0.5）。由图3可知，未加盐胁迫处理的转Rio2基因0313-19水稻幼苗根部SOD活性略高于未加盐胁迫处理的对照水稻幼苗根部的SOD活性，通过SPSS数据分析得出，差异不显著（P=0.657gt;0.05）。由此得出在盐胁迫环境下，转Rio2基因水稻幼苗和对照水稻幼苗根部SOD活性受到的影响相似。Rio2基因可能与水稻抗盐相关蛋白的合成无关，Rio2基因可能与水稻耐盐性无关。

盐胁迫下水稻幼苗根部POD 活性的变化

用100mM NaCl盐胁迫处理 Rio2基因沉默的0313-19号水稻幼苗和日本晴水稻幼苗。在盐胁迫处理0d、1d、4d、7d、10d、13d后进行随机取样，测定水稻幼苗根部过氧化物酶的活性，结果见图4。

由图4可知，随着盐胁迫处理时间的延长，盐胁迫处理的对照水稻幼苗根部POD活性与未加盐的对照水稻幼苗产生了较大差异，前者大于后者，通过SPSS数据分析得出，差异显著(P=0.037lt;0.05)。盐胁迫处理下的Rio2基因沉默的水稻幼苗根部POD活性随着盐胁迫处理时间的延长大于未加盐处理的Rio2基因沉默的水稻幼苗根部POD活性，通过SPSS数据分析得出，差异显著（P=0.026lt;0.05）。由此得出，水稻幼苗根部POD活性受盐胁迫的影响较大。未加盐处理的Rio2基因沉默的0313-19号水稻幼苗根部POD活性与对照水稻幼苗根部POD活性相似，前者略小于后者，通过SPSS数据分析得出，差异不显著（P=0.875gt;0.05）。盐胁迫处理下的Rio2基因沉默的0313-19号水稻幼苗根部的POD活性略高于盐胁迫处理下的对照水稻幼苗根部POD活性，两者均呈现先增加后减少的趋势^[16]，通过SPSS数据分析得出，差异不显著（P=0.694gt;0.05）。由此得出Rio2基因可能与水稻抗盐相关蛋白的合成无关，Rio2基因可能与水稻耐盐性无关。

盐胁迫下水稻幼苗根部超氧阴离子自由基含量的变化

用100mM NaCl盐胁迫处理 Rio2基因沉默的0313-19水稻幼苗和日本晴水稻幼苗。分别在盐胁迫处理0d、1d、4d、7d、10d、13d后进行随机取样，测定水稻幼苗根部超氧阴离子自由基的含量。结果如图5所示。

由图5可知，盐胁迫处理下的对照水稻幼苗根部超氧阴离子自由基含量随着盐胁迫处理时间的增加而增高，未加盐处理的无明显变化，前者含量一直高于后者，通过SPSS数据分析得出，差异显著（P=0.035lt;0.05）。未加盐处理下的Rio2基因沉默的0313-19号水稻幼苗根部超氧阴离子自由基含量无明显的变化，盐胁迫处理下的Rio2基因沉默的0313-19号水稻幼苗根部超氧阴离子自由基含量则呈递增状态，盐胁迫处理的Rio2基因沉默的0313-19号水稻幼苗根部超氧阴离子自由基含量高于未加盐处理的Rio2基因沉默的0313-19号水稻幼苗，通过SPSS数据分析得出，差异显著（P=0.017lt;0.05）。未加盐处理下的Rio2基因沉默的0313-19号水稻幼苗根部超氧阴离子自由基含量略高于未加盐处理的对照水稻幼苗根部的含量，通过SPSS数据分析得出，差异不显著（P=0.826gt;0.05），盐胁迫处理下的Rio2基因 沉默的0313-19号水稻幼苗根部的超氧阴离子自由基含量略少于对照水稻幼苗根部的含量，通过SPSS数据分析得出，差异不显著（P=0.650gt;0.05）。由此得出Rio2基因可能与水稻抗盐相关蛋白的合成无关，Rio2基因可能与水稻耐盐性无关。

结论

本实验探究了水稻Rio2基因的沉默能否影响盐胁迫下转基因水稻幼苗地下部分的生长，Rio2基因是否与水稻耐盐性有关。通过实验得出：水稻幼苗的生长受到盐胁迫的抑制。在盐胁迫环境下培养的水稻幼苗根部的生长发育受到了一定的抑制。根部SOD活性呈上升趋势，根部POD活性呈上升趋势，根部超氧阴离子自由基含量增加。随着盐胁迫处理时间延长，Rio2基因沉默的0313-19号水稻幼苗和日本晴水稻幼苗根部中的SOD活性与POD活性略微减小，说明盐胁迫对水稻幼苗的伤害随着盐胁迫处理时间的延长而增大。

与对照日本晴水稻幼苗相比，未加盐处理的Rio2基因沉默的水稻幼苗根部的SOD活性、POD 活性、超氧阴离子自由基含量无明显差异，可能是因为通过RNA干扰方法得到的转基因水稻中Rio2基因的沉默不彻底，或者是因为体内Rio2相关基因Rio1的存在补偿了Rio2基因的功能。

100mM NaCl处理下，日本晴水稻幼苗根部和Rio2基因沉默的水稻幼苗根部SOD、POD活性无明显差异,都是先升高然后下降趋于平缓，超氧阴离子自由基含量都是随时间的增加而增加，两者间有差异，但不显著 ，这说明Rio2基因可能与水稻耐盐性无关。

剩余内容已隐藏，请支付后下载全文，论文总字数：10867字