论文总字数：9226字

摘 要

紫萍（学名：Spirodela polyrrhiz）世界上最小的水生开花植物。紫萍适宜生长在潮湿温暖的环境中，例如水塘，池沼，稻田以及平静的湖面等，在全球广泛分布。GAF是以其与重组序列（GA/TC）_n的特异性结合的能力命名的，在基因活动过程中可以发挥多种作用，包括调节染色质的结构等。本实验以消毒处理的紫萍GAF-5基因组为模板，通过基因克隆，载体连接，感受态细胞培养等技术，通过基因克隆的手段获得紫萍14号染色体上GAF-5基因的外显子序列，并转入大肠杆菌中冷冻保存，为后期研究做准备。

关键词：紫萍，基因克隆，GAF，PCR

Abstract： Spirodela polyrrhiza the smallest aquatic flowering plant in the world is widely distributed in the world, and is suitable for growing in humid and warm environment, such as ponds, marshes, paddy fields and calm lakes. The GAF gene is named after its ability to bind alternating (GA)n or (CT)n sequences. Further reports indicate that the GAF can play several roles in the process of gene activation, including the regulation of chromatin structure. In this study, the GAF-5 genome of S. polyrrhiza, which was sterilized, was used as a template. The exon sequence of GAF-5 gene on chromosome 14 of S.polyrrhiz was obtained by gene cloning, vector connection and DNA sequencing. The exon sequence of GAF-5 gene was transferred to E.coli for cryopreservation in order to prepare for later research.

Keywords：Spirodela polyrrhiza, gene cloning, GAF, PCR

目 录

1引言 6

2 实验材料与方法 7

2.1 实验的材料 7

2.1.1 材料 7

2.1.2试剂 7

2.1.3仪器与设备 8

2.2实验流程 8

2.2.1基因组DNA提取 8

2.2.2引物设计 8

2.2.3 GAF-5基因扩增 8

2.2.4载体连接与感受态细胞培养 9

3灭菌处理 10

4实验结果分析 10

4.1 GAF-5基因片段扩增结果分析 10

4.2感受态大肠杆菌转化与培养结果分析 11

4.3阳性菌检测结果与分析 11

4.3.1阳性菌样检测结果 11

4.3.2阳性菌养检测结果分析 12

结 论 15

参 考 文 献 16

致 谢 17

1引言

GAF（GAGA-binding transcription factor）是以其与重组序列（GA/TC）_n的特异性结合的能力命名的^[1]。最开始，它被描述成Ultrabithorax( Ubx)和Engrailed( En)基因的体外激活物，随后被证明可以在hsp70热休克启动子和h3/h4组蛋白基因启动子区域与GAGA基本部分（GAGA或CTCT延伸）结合^[2-3]。进一步的研究表明，GAF在基因活动过程中可以发挥多种作用，包括调节染色质的结构。GAF由Trithorax-like（ TRL）基因编码，该基因已被证明在调节多种蛋白质的形成中是必不可少的部分^[3-5]。

最早的相关实验结果表明，在多种果蝇基因的启动子和终止子中鉴定出GAF结合位点，包括hsp70，hsp26，α1-微管蛋白等^[6]。在多梳反应元件（ lab-7 pre和bxd pre）中也发现了位点，这是抑制果蝇Hox基因和Ubx基因FAB-7结构域边界所必需的^[7]。通过对果蝇唾液腺多线染色体的免疫荧光染色实验结果表明，GAF可以大量结合常染色基因。这说明GAF在保持转录活性染色质区域开放的过程中起到作用，通过鉴定果蝇体内GAF的多达250个潜在结合位点，也间接证实了这一结果^[8]。

越来越多的研究结果表明，GAF与染色质的构象和结构变化有关，它是少数能在多个水平上调节基因表达的转录因子之一。 GAF能够与Zinc finger，Q位点与氨基酸序列连接，从而影响DNA转录翻译的结果（如图1）。Zinc Finger（锌指），是一种常用于与DNA作用的蛋白质结构元件，Zn可以是作为一部分酶的活性辅助因子，也可以被当作一些蛋白质（包含RNA聚合酶）的转录因子，它们以半胱氨酸( Cys; C )残基或半胱氨酸、组氨酸残基(His，H)两两结合，各自连接一个配价键，形成的结构象个手指状。GAF转录因子的作用结构如图2^[1]所示，它能与氨基酸序列结合，从而影响蛋白质翻译结果的表达。

图1 GAF影响蛋白质翻译结构示意图

紫萍（学名：Spirodela polyrrhiza）世界上最小的水生开花植物^[9]。紫萍适宜生长在潮湿温暖的环境中，例如水塘，池沼，稻田以及平静的湖面等，在全球广泛分布，它共包含5个属（Spirodela，Landoltia，Lemna，Wolffiella和Wolffia）37个种^[10]。紫萍的繁殖方式以无性繁殖为主，繁殖的速度很快，其数量往往足以在2~3天内翻倍^[11]。它能够在污水中生长，污水中的氮、磷含量很高，它能有效地降低污水中的N、P含量^[12]，与其它水生植物相比较，紫萍的收集方式比较简单。本实验以紫萍为实验材料，探究GAGA-bind在紫萍生物体内是否存在。

图2 GAF影响蛋白质翻译示意图

2 实验材料与方法

2.1 实验的材料

2.1.1 材料

在试验中，我们所使用的实验材料是来自505实验室经消毒处理的紫萍（S. polyrrhiza），采集自洪泽湖水域。

2.1.2试剂

本实验配制LB培养基选用沪试牌氯化钠，OXOID牌酵母浸出膏，BIOWEST牌琼脂糖。配制1.2%凝胶采用南京茂捷微生物科技有限公司生产的琼脂，505实验室配制的TAE缓冲液，宝生物工程(大连)有限公司( TaKaRa) 生产的GelRed。

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