核桃青皮中黄酮类物质抑制酪氨酸酶活性的研究

论文总字数：9979字

摘 要

植物的化学物质的调查研究，包括泡核桃种子壳的70%丙酮提取物的分离与提纯，泡核桃种子壳是一种农业残留物，从泡核桃种子壳中可分离得到五种低分子量没食子酰基单宁酸。提取物的结构为：（1）1,2,6-3-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖 ,（2）3,4,6-3-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖,（3）2,3,4,6-4-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖,（4）1,2,3,4,6-5-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖,（5）单宁酸, 主要用光谱法(NMR和MS) 和化学方法论证。进一步的研究发现这五种提取物抑制黑色素的生成，抑制细胞内酪氨酸酶的活性，也使B16F10小鼠黑色素瘤细胞内酪氨酸酶的mRNA和蛋白质表达水平下降。由此可以看出，从泡核桃种子壳分离的提取物可作为治疗色素沉着症的备选者和化妆品行业的美白剂。

关键词：泡核桃，提取物，没食子酰基单宁酸，酪氨酸酶，B16F10小鼠黑色素瘤细胞

Abstract：The phytochemical investigation, including fractionation and purification of 70% acetone extracts of Juglans sigillarid seed husks, an agricultural residue, led to the isolation of five low-molecular weight galloyltannins.The structures of the extractives were elucidated as 1,2,6-tri-O-galloyl-β-D-glucose(1),3,4,6-tri-O-galloyl-β-D-glucose(2),2,3,4,6-tetra-O-galloyl-β-D-glucose (3), 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-β-D-glucose (4), and tannic acid (5), primarily based on their spectral (NMR and MS) and chemical evidence.It was further found that 1-5 inhibited melanin production and exhibited intracellular tyrosinase activity, as well as down-regulated mRNA and protein expression levels of tyrosinase, in B16F10 mouse melanoma cells. Therefore, the isolated extractives from seed husks of J. sigillata may serve as potential candidates for hyperpigmentation remediation and as skin-whitening agents in the cosmetics industry.

Keywords：Juglans sigillata，Extractives，Galloyltannin，Tyrosinase，B16F10 mouse melanoma cell

目录

1 前言 5

2实验试剂材料与仪器 5

2.1试剂材料准备 5

2.2主要仪器 6

3 实验内容 6

3.1细胞系和细胞培养 6

3.2细胞活力检测 6

3.3 B16F10小鼠黑色素瘤细胞内黑色素含量的测定 6

3.4 RNA制备，半定量逆转录和实时聚合酶链反应（RT-PCR） 7

3.5 蛋白质印迹分析 7

4 统计分析 8

5 结果与讨论 8

5.1 没食子酰基单宁酸 1-5对细胞活性和抑制黑色素合成的影响 8

5.2 没食子酰基单宁酸1-5对酪氨酸酶在B16F10小鼠黑色素瘤细胞

内表达水平的影响 9

结论 11

参考文献 12

致谢 14

1 前言

酪氨酸酶是一种含铜糖蛋白,广泛存在于自然界中。酪氨酸酶是合成黑色素细胞的关键酶，其与昆虫表皮鞣化、果蔬褐化、人的色素障碍性疾病以及恶性黑色素肿瘤的发生与治疗有着密切的联系。酪氨酸酶利用自身的催化中心催化L-酪氨酸的羟基化到L-二羟苯丙氨酸（DOPA），并进一步向多巴醌转化（Baek et al. 2009）直至黑色素。黑色素是保护人体皮肤免受紫外线辐射必不可少的，但黑色素生产过剩和堆积在皮肤里可引起色素沉着症（Pomerants 1963）。因此，抑制酪氨酸酶活性的化合物有希望在化妆品领域应用于皮肤脱色和美白（Rout and Banerjee 2007; Zocca et al. 2010）。酪氨酸酶抑制剂在医药领域用于预防和治疗黑色素瘤、黄褐斑等色素沉着性疾病,在化妆品领域用于人体皮肤的美白,在食品工业领域用于预防果蔬因褐变而变质失鲜,在农业领域因酪氨酸酶是昆虫赖以生存的关键酶而成为最有前景的生物杀虫药剂之一,因而酪氨酸酶抑制剂的开发有着广阔的应用前景，目前对酪氨酸酶抑制剂的研究已引起国内外的广泛关注。现已发现许多具有新型结构的酪氨酸酶抑制剂，为了得到高效的酪氨酸酶抑制剂,对各种化合物的构效关系及抑制机理的研究是非常必要的。自然来源的酪氨酸酶抑制剂通常被认为是无毒副作用的和具有低成本效益的，因此从自然资源中获得和鉴定抗酪氨酸酶的化合物继续获得了国内外科研工作者极大的兴趣（Kim et al. 2006; Lerch 1987）。

泡核桃（胡桃属），一种生长很快的落叶乔木，是生长在中国西南地区西藏，四川，云南，与贵州省山区的本土植物（Wu et al. 1999）。泡核桃的种子在膳食营养方面被赋予很高的价值，他们的种子壳已经长期被用作用于治疗食管癌，胃癌，心脏病和肺癌的民间药物（Liu et al. 2010）。泡核桃的种子壳作为农业和食品工业残渣，由于其药学性质，是发展潜在的增值药品，保健品，以及化妆品的丰富资源（Ito et al. 2007）。原先关于泡核桃新鲜果壳原的研究取得了9种α-萘满酮衍生物（Liu et al. 2010）。然而，据我们所知，从来没有关于这一物种抗酪氨酸酶活性的报道。为了验证泡核桃的传统作用，并阐明其药理作用，调差研究了该植物种子壳的70％丙酮提取物，以鉴定这些提取物中的化学成分对抑制酪氨酸酶的影响。本文阐明从泡核桃提取的五种低分子量没食子酰基单宁酸对酪氨酸酶的抑制作用。

2 实验试剂材料与仪器

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