樟树内生菌的分离及其发酵液的 HPLC分析

论文总字数：7402字

摘 要

关键词：樟树，内生菌，代谢产物，高效液相色谱。

Abstract: 5 strains of entophytes were isolated from stems and leaves of camphor with tissue isolation method. The isolated endophytic fermentation metabolites and camphor extracts were analyzed by high performance liquid chromatography, and that found about 4 strains of endophytic may produce similar metabolites as the host plant.

Keywords：camphor, endophyte , metabolites, HPLC.

目 录

1 引言 ………………………………………………………………………5

2 材料与方法 ……………………………………………………………6

2.1 材料与试剂……………………………………………………………… 6

2.1.1实验材料…………………………………………………………… 6

2.1.2培养基………………………………………………………………… 6

2.2主要设备仪器……………………………………………………………… 6

2.3实验方法…………………………………………………………………6

2.3.1樟树内生菌的分离、纯化及保存………………………………………6

2.3.2内生菌发酵液及植物提取物的制备……………………………………7

2.3.3 HPLC分析条件……………………………………………………………7

3 结果与分析…………………………………………………………………7

3.1樟树内生菌分离消毒条件的确定………………………………………7

3.2樟树内生菌的分离、纯化及保存………………………………………7

3.3内生菌的的特征………………………………………………………7

3.4樟树提取物的高效液相色谱分析条件的确定……………………9

3.5发酵液高效液相色谱分析………………………………………………10

结论…………………………………………………………………………… 12

参考文献 ………………………………………………………………………13

致谢…………………………………………………………………………… 14

1 引言

樟树又称香樟、乌樟等，是樟科樟属的常绿乔木，其高度可达30 m，为亚热带常绿阔叶林的代表树种，原来生产于我国西南及东南等地，现中国长江以南各地多有生长，台湾最多^［1］。叶子形态为卵形，互生，上表面光鲜亮丽，下表面稍显灰白色。在初夏时节会开花，花较小，颜色为黄绿色，花序呈圆锥型。其果核为紫黑色，呈小球形，基部果托呈杯状。由于其全身均有樟脑香气，故民间称其为香樟，其木材十分坚硬，外表美丽，十分适宜用来制作家具、箱子等，又可以将其作为道路两旁的绿化树^［2］。

樟树好光，偏好生长于温暖湿润气候地带，耐荫能力强，耐寒性较弱，对土壤营养要求不高，耐水耐湿性较好，但移植时仍要注意保持土壤的湿度，水涝时容易烂根从导致缺氧而死亡，因此其在较难在干旱、瘠薄和盐碱等土地上上生长。樟树根系十分发达，其根可以长得十分深，故其抗风能力十分强。樟树萌芽力十分强健，故耐修剪。生长速度属于中等水平，成熟的樟树成形后犹如一把巨大的雨伞，为夏日时节人们遮避阴凉好场所。它的存活期十分长远，目前我国存活着不少几百甚至上千年的樟树古木，由于樟树在吸收烟气、毒气，滞尘、涵水、固土、防沙方面能力很强，适应城市的各种环境能力较强，可以用来抗海潮风，吸收多种有毒气体，优化城市空气，美化城市环境等^［3］。

我国对樟树的开发利用历史悠久，樟树可以用于提取樟脑、作为木材，以及它的一些衍生物，樟树叶可以用于提取樟油，樟树本身还可以用来绿化。在环境污染、资源短缺的当今社会，对樟树的开发利用越来越受到人们的关注。

樟树叶油包含多种成分，主要有：樟脑、烯类、桉叶油素、醇类等。樟树叶内成分的含量随着环境和类型的不同而各不相同^［4-5］。

植物内生菌(endophyte)是一般指那些在其生活史一定阶段或者全部阶段生活于健康植物各种组织及器官内部或细胞间隙的真菌或者细菌^［6］。从近年来的研究发现, 内生菌几乎存在与目前所知的所有植物体内, 并且种类多种多样。这些内生菌的种类主要有：真菌、细菌、霉菌和放线菌等。他们主要生长在植物表皮下的的组织当中。 植物内生菌能产生多种多样的前所未见的活性物质，这些物质可以用来生产生物防治试剂、外源基因载体以及各种新药，可以预想，在不久的内生菌将来可以在农业、医药卫生领域发挥重要作用^［7］。目前我国已经出现多位学者对内生菌进行研究并应用，有周东坡等于1999年在中国东北红豆杉中分离得到的一种能产生紫杉醇的内生菌，为紫杉醇的工业化生产以满足患者的需求开辟了新途径^［8-9］。李桂玲等人详细研究了三尖杉、南方红豆杉和香框这几种植株中的内生真菌的抗真菌活性^［10］。

但目前关于樟树内生真菌的研究较少。本实验采用组织分离法，从樟树的不同部位分离樟树的内生真菌，并对其发酵代谢产物进行HPLC分析，从而初步判断樟树内生菌是否与樟树产生的代谢产物是否相同，也为樟树的进一步开发研究提供一些参考。

2 材料与方法

2.1 实验材料与试剂

2.1.1 实验材料

健康樟树的茎、叶，采取来自淮阴师范学院文心路两旁。

2.1.2 培养基

马铃薯葡萄糖培养基（PDA）：马铃薯200 g(去皮切块煮碎过滤)、葡萄糖20 g、琼脂16 g、蒸馏水1000 ml，pH自然值。

2.2 主要仪器设备

电子天平，赛多利斯（北京）有限公司； SW-CJ-ID型生物洁净工作台，苏州进化设备有限公司；MP-250B型霉菌培养箱，上海福马设备有限公司；HZQ-Q型全温振荡器，中国·哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；RE-3000旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；HH-8数显恒温水浴锅，江苏金坛市亿通电子有限公司；SHB-III循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司；低温冷却循环泵，郑州长城科工贸有限公司；BCD-207H型海尔冰箱；inifinte1260高效液相色谱（配备G1311A四元泵、G1315B紫外检测器、G1313A自动进样器、G1379A柱温箱、部分收集器和Chemstation工作站），美国Agilent公司。

2.3 实验方法

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