论文总字数：14992字

摘 要

将内切葡聚糖酶基因egl2与巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体pPICZαB连接形成的重组载体（pPICZαB-egl2）导入大肠杆菌（Escherichia coli ）DH5α菌株，挑取阳性克隆，提取质粒，再将重组载体用BstXI酶切，线性化后电转化巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris) GS115菌株，挑取多个阳性克隆，将重组菌株接入BMGH和BMMH培养基中振荡培养，经甲醇诱导后高效表达内切葡聚糖酶，并从中筛选出高产内切葡聚糖酶的菌株PE-21，CMC酶活力达到2394.1±25.5U/ml。

关键词：内切葡聚糖酶，pPICZαB， 巴斯德毕赤酵母，表达

Abstract: In this study, Pichia pastoris expression vector pPICZαB-egl2 with endoglucanase gene egl2 was constructed and transformed into E.coil. The recobinant vector was extracted and linearized by BstXI hydrolysis. Then the linearized pPICZαB-egl2 vector was transformed into Pichia pastoris strain GS115 by electro transformation. Positive clones were selecterd and inoculate into BMGH and BMMH cultures for high-efficiency expression of endoglucanase EG-2 induced by methanol. Strain PE-21 with high-yield endoglucanase production was screened, whose CMCase activity was 2394.1±25.5 U/ml.

Keywords：endoglucanase，pPICZαB，Pichia pastoris，expression

目录

1 前言 7

1.1 纤维素酶概述及动态研究 7

1.2 里氏木霉概述 7

1.3 毕赤酵母表达体系 8

2 材料与方法 9

2.1 材料 9

2.1.1 质粒和菌株 9

2.1.2 主要仪器和设备 9

2.1.3 酶和主要试剂 10

2.2 方法 10

2.2.1 主要试剂及培养基的配置 10

2.2.2 目的基因的提取 11

2.2.3 目的基因与载体的结合 11

2.2.3.1 酶切 11

2.2.4 目的基因和表达载体的连接及克隆 12

2.2.4.1 的基因和表达载体的连接 12

2.2.5 重组子导入受体细胞 12

2.2.5.1 连接并转化大肠杆菌DH5α 12

2.2.5.2 重组子的线性化处理并回收 13

2.2.5.3 巴斯德毕赤酵母GS115菌株感受态的制备及电转化 13

2.2.5.3.1 制备方法： 13

2.2.5.3.2 巴斯德毕赤酵母的GS115电转化 13

2.2.5 目的基因的表达和检测 14

2.2.5.1 重组毕赤酵母的筛选和鉴定 14

2.2.5.2 重组毕赤酵母工程菌株的诱导表达 14

2.2.5.3 重组毕赤酵母工程菌株PE的酶表达检测 14

3 结果 14

3.1 表达载体的提取 14

3.2 毕赤酵母表达载体的构建 15

3.2.1 目的基因egl2的获取 15

3.2.2 基因egl2的回收 16

3.2.3 大肠杆菌重组子质粒检验 16

3.2.4 重组子线性化验证 17

3.3 重组毕赤酵母的筛选和鉴定 17

结 论 21

参考文献 22

致 谢 24

1 前言

1.1 纤维素酶概述及动态研究

纤维素酶是一组能够降解纤维素生成葡萄糖的酶的总称，在食品、 饲料、 医药、 纺织、 洗涤剂和造纸等工业领域有广泛的应用价值^[1]。纤维素是当今可再生利用的能源之一，是自然界分布最广，含量最多的一种多糖。纤维素可以用纤维素酶降解，一般用于生产的纤维素酶来自于真菌，比较典型的有木霉属(Trichoderma)、曲霉属（Aspergillus）和青霉属(Penicillium）。目前，能源短缺问题已经成为制约经济社会的持续发展的关键，人类开始积极探索可代替的新能源^[2]。同时纤维素酶在食品行业和环境行业均有广泛应用。而纤维素酶用于纤维素的降解，可以为糖能源的利用提供更便捷的方式，在工业生产中酒精发酵时，纤维素酶的添加可以增加原料的利用率，并对酒质有所提升。由于纤维素酶难以提纯，实际应用时一般还含有半纤维素酶和其他相关的酶，如淀粉酶（amylase）、蛋白酶（Protease）等。

纤维素酶种类繁多，来源很广，不同来源的纤维素酶其结构和功能相差很大。纤维素酶系是一类由降解方式不同的3类酶组成:(1)内切葡聚糖酶(endol，4-p-Dglucaiiase， EC3.2.1.4，简称EG或称为Cx 酶);(2)外切葡聚糖酶(exol，4-p-Dglucanase， EC3.2.1.91，简称 CBH或称为 C1 酶); (3)β-葡萄糖苷酶(p-glucosidase，EC3.2.1.21，称 BG 或纤维二糖酶)，三种酶通过协同作用降解纤维素^[3]。

由于真菌纤维素酶产量高、活性大，故在畜牧业和饲料工业中应用的纤维素酶主要是真菌纤维素酶。故纤维素目前主要研究用于工业食品生产的领域。而前段时间中央电视台主持人柴静就雾霾发表的采访录《苍穹之下》引起了社会广泛的关注，雾霾的主要来源之一为秸秆等农作废弃物的无处理燃烧，农作物的主要成分为纤维素，若能利用一定的手段将废弃农作物进行预处理成为工业生产的原料那在能源节约和环境方面都有益处，基于这一出发点，在导师的指导下进行了相关纤维素酶（内切葡聚糖基因）的分子研究。

1.2 里氏木霉概述

产纤维素酶的霉菌菌种有木霉属、根霉属和曲霉属等^[4]。木霉属真菌分泌的纤维素酶系更加全，产量更加高，而且还能分泌到胞外^[5]。里氏木霉（Trichodermareesei）是多细胞的真核微生物，红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)的无性型,隶属于丛梗孢目（Moniliales）木霉属（Penicillium）。里氏木霉所产纤维素酶和半纤维素酶包括:内切葡聚糖酶I (EGI)、EG II， EG III，外切纤维素酶I (CBHI)、CBH II，木聚糖酶I (XYLI)，XYL II， β-木糖苷酶，a-L阿拉伯呋喃糖酶，乙酰基木聚糖酯酶，甘露聚糖酶，半乳糖苦酶，木葡聚糖酶，聚半乳糖醛酸酶，内切β-l，3葡糖苷酶^[6]。在里氏木霉分泌的高效且大量的纤维素酶中，胞外纤维素酶系内，外切葡聚糖酶占60%-80%，内切葡聚糖酶占20%-36%，β-葡聚糖苷酶占1%，它们协同作用于纤维素使之降解成葡萄糖^[7]，内切酶为主要的纤维素酶。

本实验以里氏木霉的总基因组为模版，已通过引物设计PCR出内切葡聚糖基因保存于PMV载体中，供实验原材料。

1.3 毕赤酵母表达体系

巴斯德毕赤酵母曾被用于生产单细胞蛋白（SCP），有很好的发酵基础，菌体密度可达100g/L干重。其生长培养液的组分包括无机盐、微量元素、生物素、氮源和碳源，廉价而无毒。它能在以甲醇为唯一碳源的培养基中快速生长，其中醇氧化酶AOX——甲醇代谢途径的关键酶可达细胞可溶性蛋白的30%。而在葡萄糖、甘油或乙醇作为碳源的培养细胞中则检测不到AOX。AOX的合成是在转录水平调控的。其基因启动子具有明显的调控功能，可用于调控外源基因的表达。此调控作用是由一般碳源抑制/解抑制及碳源特殊诱导双重机制控制的。外源基因在甲醇以外的碳源中处于非表达状态，而在培养液中加入甲醇后，外源基因即被诱导表达。巴斯德毕赤酵母中存在着一种称为微体的细胞器，其中大量合成过氧化物酶，因此也称为过氧化物酶体。合成的蛋白质贮存于微体中，可免受蛋白酶的降解，且不对细胞产生毒害。

毕赤酵母表达系统具有以下优势：1）含有特有的强有力的AOX（醇氧化酶基因）启动子，用甲醇可严格地调控外源基因的表达；2）表达水平高，即可在胞内表达，又可分泌型表达。毕赤酵母中，报道的最高表达量为破伤风毒素C为12g/l，一般大于1g/l。绝大多数外源基因比在细菌、酿酒酵母、动物细胞中表达水平高。一般毕赤酵母中外源基因都带有指导分泌的信号肽序列，使表达的外源目的蛋白分泌到发酵液中，有利于分离纯化；3）发酵工艺成熟，易放大。已经有大规模工业化高密度生产的发酵工艺，且细胞干重达100g/l以上，表达重组蛋白时，已成功放大到10000升；4）培养成本低，产物易分离。毕赤酵母所用发酵培养基十分廉价，一般碳源为甘油或葡萄糖及甲醇，其余为无机盐，培养基中不含蛋白，有利于下游产品分离纯化；而酿酒酵母所用诱导物一般为价格较高的半乳糖；5）外源蛋白基因遗传稳定。一般外源蛋白基因整合到毕赤酵母染色体上，随染色体复制而复制，不易丢失；6）作为真核表达系统，毕赤酵母具有真核生物的亚细胞结构，具有糖基化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等翻译后修饰加工功能。

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