耐离子液体纤维素酶的发酵条件优化

论文总字数：9899字

摘 要

离子液体能够大量溶解木质纤维素，而利用水或乙醇等反溶剂的添加可以使溶解后的纤维素重新析出，重生纤维素显现出无定形的疏松结构，大幅提高了纤维素酶的可及度，从而可以显著提升酶解效率，然而重生纤维素中残留的离子液体对酶活力的损伤仍是一个瓶颈问题，因此发酵生产能够耐受离子液体的纤维素酶具有重要的实际意义。在该研究中，我们选取实验室保存的一株耐受离子液体的纤维素酶产生菌Trichoderma aureoviride HS为目标菌株，通过对其发酵碳源、氮源、氧载体等因素的考察，确定影响菌株发酵产酶的关键因素，进一步结合正交试验设计对产酶培养基进行组合优化，获取该菌株的最佳产酶培养基，以期为高效酶解离子液体预处理的木质纤维素提供高活力的酶液。

关 键 词：耐离子液体，纤维素酶，稻草，预处理，发酵条件优化

Abstract: Ionic liquids can dissolve a lot of lingo-cellulose, and the cellulose can be re-precipitated with the addition of water or ethanol. The regenerated cellulose showed amorphous loose structures. The accessibility of cellulase can be improved significantly, which can improve the efficiency of digestion. However, the residual ionic liquids in the regenerated cellulose is harmful to the cellulases, which is still a bottleneck. So it is significant to develop the cellulases that can be tolerance of ionic liquids. In this study, we selected a strain producing ionic liquids tolerant cellulase in the laboratory, Trichoderma aureoviride HS, as the target. By examining its fermentation carbon, nitrogen, oxygen carrier and other factors, the key factors that affecting the strain fermentation in enzyme production were determined. Furthermore, integration of orthogonal was designed to optimize the enzyme production medium, and the best medium for enzyme production of Trichoderma aureoviride HS was determined. It provided high activity of cellulase solution for the efficient hydrolysis of ionic liquid pretreated lignocellulose.

Keywords: Ionic liquid resistance, cellulase, rice straw, Pretreatment, Optimization of the fermentation

目 录

1 引言 4

2 材料和方法 5

2.1 材料 5

2.2 实验方法 6

2.3 发酵产酶培养基组分的优化 7

3 结果与讨论 8

3.1不同碳源对产酶的影响 8

3.2 不同氮源对产酶的影响 9

3.3 不同氧载体对产酶的影响 10

3.4 正交试验 11

3.5 验证试验 12

4 结论 13

5 展望 14

参考文献 15

致 谢 16

1 引言

纤维素是世界上最大的可再生生物资源和最丰富的多糖物质。我国的纤维素资源极为丰富，仅皮壳和秸秆每年就能产数亿多吨^[1]。但是这些原料大部分被烧掉，这样不仅破坏了生态平衡，还污染了环境，而且能量利用率也很低，只有10%左右^[2]。运用微生物来降解天然纤维素生成单糖，单糖再通过微生物发酵来生产各种有用的产品，如：饲料、食品、药品、燃料、化工原料等^[3]，将对解决现今世界所面临的能源危机、和可持续发展具有十分重要的意义^[2]。纤维素是一种多糖类物质，它的组分比较单一，由多个纯的脱水D-葡萄糖组成，是D-葡萄糖以β-1，4-糖苷键连接起来所形成的一种高分子聚合物，分子式可以用Cm(H₂O)n来表示。天然纤维素的分子结构一般都很复杂，通常结合了很多其他物质，比如：木质素、半纤维素、果胶、树胶、丹宁等间隙物质，导致它的结构呈现出高度木质化和晶体状，使得纤维素酶分子很难入侵到其内部对它进行有效的酶解^[1]。所以在对纤维素进行降解之前，一般都会先使用化学、物理或者生物的方法对它进行预处理，来保证纤维素和纤维素酶的充分接触，从而提高酶解效率。研究表明某些离子液体能够大量溶解纤维素类碳水化合物。作为近年新兴的一种木质纤维素预处理方式，离子液体预处理能有效降低纤维素的结晶度及聚合度，提高纤维素酶解效率。

纤维素酶是一种活性很高的生物催化剂^[4]，它不是单一的酶，而是一类较复杂的酶复合物，它的组分分为3类：葡聚糖外切酶(exoglucanses , CBH)，这类酶能够从纤维分子的非还原端依次水解β-1，4-糖苷键，切下纤维二糖分子；葡聚糖内切酶(endoglucanases, EG)，这类酶能够在纤维素分子内部随机地水解β-1，4-糖苷键，生成大量的小分子纤维素；β-葡萄糖甘酶(β-glucosidases, BG)，这类酶能够将纤维二糖分子及其他的低分子纤维糊精水解生成葡萄糖^[5]。关于纤维素酶的作用机理，至今仍然没能达成一致意见，不过目前多数人都认为是纤维素酶的各组分协同作用来降解纤维素的。有不少学者对此提出过不同的观点，比如：协同作用假说、顺序作用假说、C1-Cx假说、碎片理论等等^[6,7]。由此可见，对纤维素酶系的作用机理以及它们各组分间的相互作用关系，到目前为止并没有完全研究清楚，还有待进一步研究和探讨。

前期研究中课题组以[Amim](Cl)为筛选压力从化工厂污染土壤中获得了一株产耐离子液体的纤维素酶产生菌 Trichoderma aureoviride HS ，该菌所产纤维素酶体现出较优越的离子液体耐受性，并且基于该酶课题组已成功构建了一个离子液体-纤维素原位酶解体系。为了进一步减少该酶的生产成本，优化上述体系的酶解效率，我们进一步对该菌的发酵产酶条件进行优化。

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