耐受离子液体纤维素酶产生菌的筛选

论文总字数：12454字

摘 要

从长期受到化学污染的土壤微环境中采集样品，通过富集培养和滤纸平板筛选分离出能够耐受离子液体并具有纤维素降解能力的菌株，再通过摇瓶发酵测定酶活力从中筛选出1株相对高活性的产纤维素酶菌株HY，经菌种鉴定为烟曲霉Aspergillus fumigatus。通过考察该菌株在离子液体中的耐受能力，发现该菌株在30%(w/v)浓度1-乙基-3-甲基咪唑磷酸二甲酯盐([Emim][DMP]) 、氯化1-烯丙基-3-甲基咪唑([Amim][Cl])和1-乙基-3-甲基咪唑硫酸甲酯盐([Emim][MA])中的最大酶活分别达到127%，111%和109%，比在缓冲溶液中提高了9%~27%，表现了它在高浓度离子液体中的优越水解性能。

关 键 词：纤维素酶，离子液体，筛选，烟曲霉

Abstract：Samples collected from chemically polluted microhabitats were incubated for enrichment culture, and then strains capable of decomposing cellulose which can tolerate the ionic liquids were screened out with the filter paper plates. Enzyme activities of the strains were measured and one strain, relatively higher in cellulase-producing activity, was isolated as HY. The strain was identified as Aspergillus fumigatus. The maximum activity of the cellulase in 30% (w/v) ionic liquids (ILs) was detected in [Emim][DMP], [Amim][Cl] and [Emim][MA] as 127%, 111% and 109%, respectively, of its activity in buffer, suggesting its superior performance in high concentration ILs.

Keywords: cellulase, ionic liquids, screening, Aspergillus fumigatus

目 录

1 引言 4

2 材料和方法 5

2.1 材料 5

2.2 方法 6

3 结果与讨论 9

3.1 菌株的筛选 9

3.2 菌种的鉴定 10

3.3 纤维素酶在离子液体中的水解活力 11

结论 13

参考文献 14

致 谢 16

1 引言

纤维素不仅是地球上最丰富的有机物质，而且是地球上最丰富、最廉价、年产量巨大的可再生资源^[1-4]。我国纤维素类可再生资源非常丰富，仅农作物秸秆每年就5.7×10⁸ t^[5]。然而大部分农作物秸秆都会在田间烧毁，既降低能源利用率又污染环境^[6]。有限的化石燃料储备和全球气候变化，激发了人们寻找替代燃料的可再生生物能源的巨大兴趣。木质生物质富含丰富的纤维素，对于生产生物燃料和高值化学物质来说是一个潜在的有用原料来源。然而，由于其高度木质化和晶体结构，木质生物质通常难于进行有效的酶法水解。在传统酶解技术中酶与底物接触面积低是瓶颈问题。为了实现高效利用木质纤维素类生物质，不同的化学、物理和生物预处理方法已经被开发出来。然而，大多数预处理方法通常采用高压、高温或严酷的化学环境，并且不良副产品的形成也是一个相当大的问题。近年，离子液体开始被用于木质纤维素的预处理。研究证实从离子液体中重生的纤维素具有多孔和疏松的结构特性，从而更容易被纤维素酶所降解^[7]。然而，在这类方法中，酶法水解工序发生在纤维素的重生之后，这就在整个工艺中引入了纤维素再生过程和重生纤维素的液固分离，从而增加总工艺成本。为了避免这个大规模的重生-分离过程，Kamiya等人提出了“原位糖化”的概念，将离子液体中纤维素的重生及后续的酶解过程整合到一个体系中^[8]。研究表明，通过调整比率(N-ethyl-N-methylimidazolium diethyl phosphate/H₂O=1：4, v / v)，超过50%的纤维素可以在24小时内被原位转化成还原糖。然而到目前为止，在该体系中纤维素水解为葡萄糖的效率还不够高，这主要是由于在离子液体体系中纤维素酶活性显著降低以及体系中纤维素依旧大量以固态存在所致。解决该问题的方法是实现离子液体中溶解态纤维素的原位酶解（即保持体系中纤维素以溶解状态存在）。但保证这种状态需要高浓度的离子液体的存在，这往往会导致纤维素酶的快速失活。因此，选择或开发一种新型纤维素酶在能够在高浓度的离子液体体系中保持高的活力具有重要的实际意义。
在早先的研究中，大量的商业纤维素酶被用来考察其离子液体耐受性。然而大部分的纤维素酶，包括从里氏木霉来源的酶，在离子液体浓度高于20%(v/ v)时即迅速失活^[9]。同时一些来源于宏基因组及环境分离菌株的纤维素酶的离子液体耐性也正在被大量研究^[10]。值得一提的是Reddy 从海洋细菌 Pseudoal-teromonas sp 中获得一种耐受离子液体的纤维素酶，并将其成功应用到原位纤维素预处理/酶解的体系中^[11]。
同时， 有文献报道从嗜热微生物中获得一种糖苷水解酶，该类酶能够耐受高达30%的离子液体，这表明极端微生物可以作为特殊水解酶的重要开发来源^[12]。然而目前针对耐受离子液体的纤维素酶的研究只要基于一些疏水基团的离子液体，这些溶剂虽然本身的生物毒性低但对木质纤维素预处理的效果较差，不能很好的溶解纤维素，从而降低了其在产业中的实际应用价值。
为了进一步拓展离子液体中的原位酶解技术，开发并发酵生产能在高浓度离子液体中存活的纤维素酶具有重要意义。降解木质纤维素的微生物经常处于一些恶劣的环境中，因此在这些微生境开发具有压力耐受性的微生物或纤维素酶具有极大的概率性。

He 课题组报道从土壤中筛选获得一种新颖的耐受  N-methyl-morpholine-N-oxide 的纤维素酶产生菌株Galactomyces sp. CCZU11-1^[13]。来源于极端微生物的酶通过长期的进化得以适应特殊的微生境，通常具有耐受特殊环境的特性。因此从极端环境中筛选特殊微生物及其产生的纤维素酶离子液体耐受性是一种切实可行的研究方案。

离子液体是一类非挥发性盐溶液，研究表明某些离子液体能够大量溶解纤维素类碳水化合物。作为近年新兴的一种木质纤维素预处理方式，离子液体预处理能有效降低纤维素的结晶度及聚合度，提高纤维素酶解效率。但离子液体对纤维素酶的毒性是限制该技术得以应用的关键问题。本研究拟从长期受到化学污染的土壤微环境中筛选分离能够耐受离子液体的纤维素酶产生菌，进一步考察相应纤维素酶的离子液体耐受能力，以期获得能够高度耐受离子液体的新型纤维素酶^[13]。

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