酵母菌以玉米浆为氮源发酵产柠檬酸的研究

论文总字数：16588字

摘 要

在含有葡萄糖和酵母提取物的培养基中，解脂耶罗维亚酵母SWJ-1b（Yarrowia lipolytica SWJ-1b）能产生大量的柠檬酸。我们发现玉米浆是一种能够刺激柠檬酸生产的经济氮源，并且能够通过调节柠檬酸合成途径中的相关酶活力促使代谢途径中的碳代谢流向柠檬酸。同时，我们以CaCO₃作为发酵培养基的中和剂进行实验。结果发现，添加在柠檬酸发酵培养基中的各成分的最佳含量为玉米浆1.0 g/l，CaCO₃ 40.0 g/l，葡萄糖60.0 g/l。在此条件发酵下，摇瓶中的柠檬酸产量为49.2 g/l，异柠檬酸产量为5.9 g/l。进一步以3-L发酵体系进行发酵，柠檬酸产量达到52.3 g/l，产率达到0.9 g/g 葡萄糖，在288小时内的柠檬酸生产力为0.18 g/l/h。而异柠檬酸产量仅为5.5 g/l，发酵结束时葡萄糖利用率达到96.7%。

关键词：柠檬酸，玉米浆，Yarrowia lipolytica，CaCO₃，发酵

Abstract: Yarrowia lipolytica SWJ-1b is able to produce a large amount of citric acid in the medium containing glucose and yeast extract. It was found that corn steep liquor (CSL) could stimulate citric acid production as an economic alternative providing nitrogen, and could improve carbon flux to citric acid by adjusting the activities of enzymes involves in citric acid biosynthesis pathway. At the same time, CaCO₃ was added in the medium as a neutralizer. It was found that 1.0 g/l of CSL, 40.0 g/l of CaCO₃, 60.0 g/l of glucose were the most suitable for citric acid production. Under the optimal conditions, 49.2 g/l of citric acid and 5.9 g/l of isocitric acid was yield in shake flask cultivations. During 3-L fermentation, 52.3 g/l of citric acid, a yield of 0.9 g/g of glucose, and a productivity of 0.18 g/l/h were reached within 288 h of the fermentation. Only 5.5 g/l of isocitric acid were attained and 96.7% of glucose was used in this process.

Key words: citric acid, corn steep liquor, Yarrowia lipolytica, CaCO₃, fermentation

目 录

1 前言 3

2 材料和方法 5

2.1 材料 5

2.2 方法 6

2.3 产物产量测定 6

2.4 酶活力测定 7

3 结果 7

3.1 玉米浆对Y. lipolytica柠檬酸发酵的影响 7

3.2 以玉米浆为氮源时Y. lipolytica胞内碳通量变化 8

3.3 发酵最佳CaCO₃添加量的确定 8

3.4 发酵最佳碳源初始浓度确定 9

3.5 发酵过程的产物产量及葡萄糖含量变化 10

4 讨论 11

结论 13

参考文献 14

致谢 16

1 前言

柠檬酸（Citric acid）又名枸橼酸, 其学名为3-羟基-3-羧基戊二酸，是三羧酸循环中的关键中间产物，在自然界中分布广泛，主要存在于柠檬、柑橘、梅子等果实中，广泛应用于食品、医药及日化等众多领域，是一种十分重要的有机酸。目前，柠檬酸全世界消耗量已达120万吨，年产能达160万吨，市场贸易量为90多万吨，且每年以7%的增长率增长。柠檬酸的生产方法主要有天然植物提取法及生物发酵法两种，其中，90.0%以上的柠檬酸是通过微生物发酵的方式获取的。我国发酵柠檬酸的主要原料有淀粉、玉米粉、葡萄糖、稻米粉及木薯粉等，而欧美等国家则采用葡萄糖，淀粉等精料进行发酵，因而我国的柠檬酸产品一直因较低的价格在世界柠檬酸市场上占绝对优势^[1]。

可以发酵生产柠檬酸的菌种众多,其中黑曲霉（Aspergillus niger）是目前柠檬酸大规模工业化发酵采用的主要菌种，最为广泛应用的为菌株N558及C-144-131。然而，A. niger能引起肺曲霉肿类疾病一直是柠檬酸生产中存在的重大安全隐患，且该菌在柠檬酸发酵过程易引起重金属污染等环境问题^[2,3]，这些缺点限制了其在柠檬酸工业生产中的发展。解脂耶罗维亚酵母（Yarrowia lipolytica）作为一种安全的（已经过美国食品及医药管理局认定）高产柠檬酸的酵母菌，在柠檬酸发酵领域具有独特而重要的地位。Y. lipolytica对低溶氧及重金属环境敏感性较低，因而可以直接利用粗原料及工农业废弃物发酵柠檬酸，此外，该菌简单的单细胞结构使其更易于被遗传改造^[4]，以上优点赋予了Y. lipolytica在柠檬酸发酵产业中的巨大潜力，因而使得该菌在近年来受到广泛的关注。

Y. lipolytica的柠檬酸生物合成的代谢途径如图1中所示。首先葡萄糖通过糖酵解转化为丙酮酸，后者在丙酮酸羧化酶的作用下通过固定CO₂转变成草酰乙酸，草酰乙酸被转运到线粒体内通过三羧酸循环转变成柠檬酸和其他的有机酸^[5]。丙酮酸羧化酶（Pyruvate carboxylase, 简称PYC）（EC6.4.1.1）作为胞内代谢碳流量的枢纽，在该过程中起着关键作用。在碳代谢过程中，很多中间产物被用于各种物质的合成而被消耗，这些被消耗的中间产物需通过添补反应来补充，以维持胞内正常代谢和进一步的物质合成，并由此影响有机酸的合成。在大多数异养生物中，添补反应主要通过PYC催化的羧化反应来完成。PYC是一种生物素依赖型四聚体酶，这表明包括柠檬酸在内的大部分有机酸的生物合成过程都需要生物素的参与。

玉米浆是玉米淀粉等产品加工过程中浸渍处理的主要副产物，经浓缩后固形物含量约70%左右。玉米浆成分较为复杂，除蛋白质含量较高以外（高于40%，按干重计），氨基酸、生物素和维生素（如烟酸等）含量也较为丰富，因此，作为一种良好的微生物生长或代谢产物合成的促进剂，玉米浆已被广泛应用于酶制剂、抗生素、生化药物等众多发酵产品的生产过程，同时，有报道称，玉米浆也是一种有机氮的极好来源^[6]。目前，玉米浆已经在多种有机酸如乳酸、苹果酸和琥珀酸的发酵生产中作为氮源及生物素源^[7~9]。此外，玉米浆作为一种经济的低成本氮源，在工业生产上代替昂贵氮源如蛋白胨和酵母提取物也颇具潜力^[6]。

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