论文总字数：28136字

摘 要

背景：

氧化石墨烯（GO）作为一种新的纳米材料，由于其优异的光、电等方面的特性，使其在药物载体，生物传感器，荧光成像等领域发挥重要作用，GO 在给人类带来

巨大利益，但其毒副作用与分子机理尚未完全解析。

秀丽线虫（Caenorhabditis elegans），目前已经成为一个公认有价值的环境生物指示物以及毒理学研究替代的生物，因为其具有易于在实验室繁殖、繁殖周期短、遗传背景清楚、成本低廉等优点，这在毒理学研究方面是至关重要的。

方法：

首先我们对秀丽线虫利用浓度为100mg/L的GO进行延长暴露，选择寿命、运动行为、肠道ROS 诱导、GO 在秀丽线虫体内的分布等指标作为评价终点，系统解析GO 致毒效应和体内转运。通过生物信息学的软件对所得数据进行分析，以得到GO对秀丽线虫的在体毒性和转运。

结果：

1. mir-235 对GO 致秀丽线虫在体毒效应的调控作用及对转运的影响；
2. Daf-12对GO致秀丽线虫在体毒性的调控作用及组织特异性。

结论：

本次实验证明了GO对模式动物秀丽线虫有一定的毒性影响。秀丽线虫mir-235调控GO在体毒性，mir-235 在GO 暴露线虫中寿命的显著变化以及mir-235 突变体对GO 毒性具有敏感性。而daf-12表现为抗性。我们猜测mir-235可能通过靶向daf-12 基因从而起到调控GO 致秀丽线虫转运和毒性的作用。

关键词：氧化石墨烯（GO）；秀丽线虫；mir-235；毒性评价

Abstract

Background:

With its optical transmittance and electronic properties, graphene oxide (GO), a novel member of carbon nanomaterials,which make it a promising material for a wide range of applications, particularly in photothermal therapy, biosensors and anti-bacterial materials.Nevertheless, the mechanism of toxicity have not been thoroughly examined will be formed along with the huge economic benefits and technical breakthrough of GO.

Caenorhabditis elegans,has now become a recognized valuable environmental biological indicators and toxicology study alternative, because it is easy to reproduce in the lab, cycle short, clear genetic background, the advantages of low cost, it is of vital importance in toxicology research.

Methods:

First of all, we in the c. elegans using concentration of 100 mg/L GO to Prolonged exposure.we employed the endpoints of lifespan, locomotion behavior, intestinal ROSinduction, in the in vivo assay system of C. elegans to perform the systematic study on investigate the effects on toxicity and translocation of GO.Through bioinformatics software to analyze the data, in order to get the GO for the c. elegans in vivo toxicity and translocation.

Results:

1. investigate the effects of mir-235 mutation on toxicity and translocation of GO.

2.DAF-12 in regulating toxicity and translocation of GO and the tissue-specific

activities .

Conclusions:

This study will provide evidence to GO on model animal c.elegans has cartain toxic effects.mir-235 in regulating the toxicity and translocation of GO in nematodes，Mir - 235 in the exposed nematodes of significant changes in the life and Mir - 235 mutants have sensitivity to GO toxicity.The daf - 12 performance for resistance.we will confirm the targeted relationship between mir-235 and daf-12 during the control of GO toxicity and translocation.

Keywords: C. elegans, graphene oxide (GO), mir-235,toxicity evaluation.

目录

秀丽线虫mir-235调控氧化石墨烯在体毒性 及转运的研究

Abstract

目录

前言

第一章 microRNA的研究进展

一．microRNA概述

1.1 秀丽线虫的microRNA

1.2 microRNA的功能

二 microRNA对毒性调控的研究进展

2.1 microRNA对秀丽线虫体内的GO毒性的调控

2.2 microRNA对PCBs暴露ApoE-／-小鼠肝脏的调控

2.3 microRNA在其他动物在体毒性中的作用

三． MicroRNA研究方法

3.1.microRNA的分离

3.2.miRNA检测方法

3.3 microRNA数据库及靶标预测工具

3.4 靶标验证工具

3.5 miRNA的调控功能研究

四．总结与展望

第二章 秀丽线虫mir-235调控氧化石墨烯 在体内的毒性及转运

1.实验方案

1.1 GO 的制备及表征分析

1.2 mir-235 突变对GO 在秀丽线虫中转运和毒性的影响

1.3 靶标预测

1.4 daf-12 突变对GO 在秀丽线虫中转运和毒性的影响

2. 实验材料及仪器

2.1 材料

2.2 仪器

2.3 主要试剂及溶液

2.4 主要试剂配制方法

3.实验方法

3.1 GO的制备

3.2秀丽线虫的培养

3.3 线虫同步化与暴露

3.4 mir-235 突变对GO 在秀丽线虫中转运和毒性的影响

3.5 候选靶基因daf-12 调节GO 转运和毒性效应

3.6 对比GO 在野生型N2 以及daf-12 突变体中的毒性效应

第三章 结果分析

4.1 mir-235 突变体中的毒性效应

4.2 预测mir-235的靶基因

4.3 daf-12突变体中的毒性效应

4.4 mir-235与daf-12运动行为分析

4.5 GO 暴露对秀丽线虫肠道通透性的影响

4.6 GO 暴露后的转运和分布

第四章 讨论与展望

致谢

前言

石墨烯是一种只有一个原子厚的二维碳膜——的确是种令人惊讶的材料。虽然名字里带有石墨二字，但它既不依赖石墨储量也完全不是石墨的特性：石墨烯导电性强、可弯折、机械强度好，看起来颇有未来神奇材料的风范。如果再把它的潜在用途开个清单——保护涂层，透明可弯折电子元件，超大容量电容器，等等——那简直是改变世界的发明。连2010年诺贝尔物理学奖都授予了它。

石墨烯是人们发现的第一种由单层原子构成的材料。碳原子之间相互连接成六角网格。铅笔里用的石墨就相当于无数层石墨烯叠在一起，而碳纳米管就是石墨烯卷成了筒状。

石墨烯家族纳米材料（GFNs） 主要包括单层石墨烯，少层石墨烯（2-10层石墨烯片层），GO（正常为一层），rGO（正常为一层），石墨烯纳米片层，超薄石墨烯（多于10层但厚度低于100nm），带状石墨烯和点状石墨烯等。

对于前景一片光明的氧化石墨烯来说，越来越多的关于GO的毒性效应研究目前已经开展，除了利用我们常见的模式动物秀丽线虫，小鼠，斑马鱼，果蝇等进行体内毒性的试验；还利用人乳腺癌细胞系 MCF-7，MDA-MB-435，人肠癌细胞系MGC803，及肝癌细胞系 HDF，HepG2，，SH-SY5Y 细胞，小鼠成纤维细胞系L929等细胞进行的体外GO毒性评价。最近对GO在哺乳动物细胞体外培养的毒性研究表明，当GO浓度过高对人成纤维细胞具有毒性，并且毒性与浓度相关[4]。除此之外，GO能够引起红细胞破裂，导致血红蛋白释出[5]。

秀丽线虫（Caenorhabditis elegans）的发育与遗传背景是研究相对清楚的模式动物，雌雄同体成虫有959个体细胞;雄成虫有1031个，且每一个体细胞(somatic cell)的发育情况都研究得较为清楚。目前已经成为一个公认有价值的环境生物指示物以及毒理学研究替代生物。与其它模式生物相比，秀丽线虫繁殖速度快并且可以大量获得，生长周期短，从受精卵发育成一个成虫仅需55h，这些特点对研究纳米材料潜在的毒性而言是至关重要的。目前，针对环境污染和生态毒理学的研究，越来越多的人选择秀丽线虫作为指示生物。并且在2002年，诺贝尔生理医学奖颁发给Sydney Brenner、John Sulston和H. Robert Horvitz以表扬他们通过对C. elegans的研究揭示细胞的程序性死亡(programmed cell death,PCD)机制，及器官发育遗传学的贡献。

microRNAs（miRNAs）是一种小的内源性非编码RNA 分子，广泛存在于真

核生物细胞中，是长约21～25 个碱基的单链小分子RNA[6]。每个miRNA 可

以有多个靶基因，而不同miRNA 也可以调节同一个基因。根据Mirbase(release 10.1）数据库显示，大约60%秀丽线虫的miRNA 和人类同源[7]。

本次实验我首先利用GO延长暴露，通过mir-235突变体线虫与野生型线虫N2对比，使用一系列评价体系研究了GO对秀丽线虫体内可能产生的负面影响以及mir-235对GO的调控作用。然后，我们探讨了mir-235所作用的靶基因，选定重要的候选基因，进一步研究秀丽线虫mir-235调控氧化石墨烯在体毒性及转运。

综上所述，本次实验利用具有优势的模式动物秀丽线虫，研究GO的毒性。从分子水平上，解读备受关注的小分子microRNA对氧化石墨烯在体毒性及转运的调控。

第一章 microRNA的研究进展

摘要：microRNA是一类只有18~25个碱基的单链小分子RNA，是一种小的内源性非编码RNA，广泛存在于线虫，病毒和人类中。在动物中，microRNA通过与靶基因的结合来调控其表达。功能涉及甚广。本文通过简单叙述microRNA的调控机制以及功能，同时，详细叙述其对毒性的调控和研究方法，试图揭开microRNA神秘的面纱。

关键词：microRNA，功能，毒性调控机制，研究方法

引言：

1993年，Lee^[1]等在研究线虫它通过线虫胚胎发育时间控制缺陷型遗传筛选时发现了第一种miRNA(1in-4)以来，迄今在生物界发现和鉴定的miRNA已经超过5 000种，从病毒到高等脊椎动物的基因组中都含有miRNA的编码信息．microRNA 是一类仅有18~25个核苷酸的单链小分子RNA，具有高度的保守性、组织特异性和时序性等特点。microRNA基因在相近种属之间具有较高的保守性，如不同种属的线虫有85%的同源基因，人和恒河猕猴等灵长类动物也有很高的同源性^[2]。

一．microRNA概述

1.1 秀丽线虫的microRNA

microrna在秀丽隐杆线虫的存在是由Li首次发现的。另外秀丽隐杆线虫的154个 microrna是被随后科学家发现[3]。值得注意的,最近的研究表明,microrna在秀丽隐杆线虫与哺乳动物中具有相似的属性。根据miRBase(10.1版本)数据库,大约62%或55 - 62%microrna的秀丽隐杆线虫和果蝇和人类[4],更重要的是34个microrna在秀丽隐杆线虫保存在其他物种[5]。在秀丽隐杆线虫microrna的表达水平在不同的发展时期是多种多样的[6]。

在秀丽隐杆线虫中发现的microrna有其必然性。秀丽隐杆线虫,线虫的亚型,是第一个已知的动物全基因组序列。它的全基因组编码约20000基因,至少40%的相同器官基因在人类基因组。它有两个性别,雌雄同体和雄性。雌雄同体是常见的进行遗传交配和分析性征。因为清楚线虫的发育机制周期(胚胎发生和四个幼虫阶段:L1-L4)秀丽隐杆线虫也用于研究生物发育,如蜕皮机制。在有利的环境中,幼虫发育是快速和持续的。然而,在不利的环境秀丽隐杆线虫将进入生长停滞,生存长久,和高应力阶段被称为滞育时期。此外,最近的研究发现,一些滞育时期的microrna和蛋白质在其他非滞育阶段动物的幼虫是不同的。这些秀丽隐杆线虫的特性提供了一个很好的动物模型研究细胞分化机制、开发和老化。1974年,布兰诺乙基使用(EMS)诱发野生型秀丽隐杆线虫和化学诱变建立300突变体的行为和特点形态学。秀丽隐杆线虫奠定了基础在动物行为和开发基因研究。在1977年,Sulston使用微分干涉对比(DIC)技术研究不同表型的细胞在秀丽隐杆线虫和特征描绘了一幅独特的细胞命运谱系图,为科学家们提供了一个平台研究基因调控机制的发展。

1.2 microRNA的功能

1.2.1 microRNA与固有免疫

现代免疫学认为，固有免疫是机体在长期的种系发育与进化过程中逐渐形成的一种天然免疫防御功能，是宿主抵御病原微生物入侵的第一道防线。研究表明，miRNA的表达作为细胞接收到外源或内源的压力信号后的一种早期反应，参与了固有免疫应答过程。Chen等^[8]最近报道，人胆囊上皮细胞能够表达let7 miRNA家族成员如let 7i直接与TLR4 mRNA3'-UTR发生互补结合而调节其表达。

Moschos等^[9]也发现了许多可能参与炎症反应负向调节的miRNA。Tili等^[10]发现炎症因子表达的调节中存在着互相拮抗的miRNA,如miRNA—155和miR-125b对TNF-α仅的表达有相反的调节作用．小鼠巨噬细胞系RAW264．7受到LPS刺激后，miR-155表达上调而miR-125b表达下调．

1.2.2 microRNA与动植物生长发育

microRNA的多样性与进化保守性决定了在生理生化功能上的重要性与普遍性.在线虫中除了最早发现的lin4,let7参与线虫的形态转换,还发现第一个与神经模式发生有关的miRNA lsy6。有证据表明lsy6能影响左右神经系统内某一特定化学感受器受体的水平,这可部分解释神经系统功能的非对称性。^[11]此外,在细胞水平上，有鉴定出小鼠干细胞和已分化细胞的miRNA，发现有些miRNA是干细胞特有的,推测它们是维持细胞全能性所必需或并参与细胞分化过程。另外的一些miRNA呈组织特异性表达,这似乎表明它们与维持分化细胞的功能有^[12]。

miRNA的正常表达是植物发育生长所需要的.microRNA通过抑制转录因子来达到控制花的发育以及叶的近轴与离轴细胞的分化方向。

1.2.3 mir-235对线虫滞育的研究

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