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摘 要

abstract3

1. 文献综述4

1.1概述4

1.2氨基酸产业的发展4

1.2.1D-氨基酸的研究进展4

1.2.2D-氨基酸在生物体的分布4

1.3 D-氨基酸的应用5

1.3.1D-氨基酸在食品上的应用5

1.3.2D-氨基酸在医药领域的应用6

1.3.3D-氨基酸在农业的应用6

1.4D-色氨酸的价值与生产方法6

1.5D-氨基酸的制备方法及其进展6

1.6D-氨基酰化酶的发展6

1.6.1 D-氨基酰化酶的理化性质6

1.6.2D-氨基酰化酶的作用原理7

1.6.3D-氨基酰化酶的研究进展和意义7

1.7本课题的研究意义8

第二章来源于天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)的D-氨基酰化酶克隆表达8

2.1D-氨基酰化酶的氨基酸序列8

2.2密码子的优化结果8

2.3克隆过程9

2.4D-氨基酰化酶的诱导表达9

2.5SDS-PAGE检测9

2.6菌种的扩大培养9

2.7茚三酮显色法测定D-色氨酸含量9

2.7.1茚三酮显色法原理9

2.7.2茚三酮对菌液进行检测9

2.7.3纸层析法检测10

第三章 实验材料与实验方法10

3.1实验材料与器械10

3.1.1 试剂10

3.1.2实验室器械11

3.2实验方法12

3.2.1源于天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)的D-氨基酰化酶克隆表达12

3.2.2准备步骤12

3.2.3大肠杆菌的接种和活化12

3.2.4SDS-page 检测13

3.2.5发酵罐扩大培养14

3.2.6茚三酮显色法检测D-色氨酸14

第四章 实验结果15

4.1大肠杆菌的接种和活化15

4.2 SDS-page电泳结果15

4.3茚三酮检测菌液d-氨基酰化酶活性16

4.4纸层析检测D-氨基酰化酶活性16

第五章 讨论17

结论18

致谢19

参考文献19

摘要：

D-氨基酸作为非天然氨基酸的一种，不仅具有许多天然氨基酸的功能，同时也具有许多非天然氨基酸不具有的性能，在食品、医药、农业方面均有广泛用途。其中，D-色氨酸对人和动物的生长发育、新陈代谢起着重要的作用，在食品饲料工业以及农业中可以作为非营养甜味剂、饲料添加剂、植物生长剂 ，在医药行业中，主要用于合成各种多肽，代替L-色氨酸延长肽类药物的半衰期并降低副作用，不致产生抗药性而成为酶抑制剂的重要合成前体。能提高机体的免疫能力，延缓过敏性反应的发生。

酶法制取D-色氨酸主要靠D-氨基酰化酶能够合成D-氨基酸，通过将DL-氨基酸进行乙酰化，反应生成DL-N-乙酰氨基酸，之后利用氨基乙酰化酶针对L型氨基酸进行水解，之后对D-N-乙酰氨基酸进行消旋化，从而得到D-氨基酸。本课题即针对D-氨基酰化酶对DL-色氨酸的拆分作用进行研究。

本文采用基因工程技术将来源于天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)的D-氨基酰化酶基因进行密码子优化，将合成基因接入表达载体pET-30a-c( )，构建pET30a/natd表达质粒；最后将表达载体pET30a/natd转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中。活化菌株并利用IPTG进行诱导，之后利用SDS-PAGE电泳检测D-氨基酰化酶是否在大肠杆菌内表达。之后利用检测成功的大肠杆菌判断合成的D-氨基酰化酶是否有活性，直接将底物与茚三酮溶液及大肠杆菌菌液共培养，根据变色状况检测活性。接着利用发酵罐对大肠杆菌菌体进行扩大化培养，离心破碎获得大量的D-氨基酰化酶后进行纸层析检测。

本实验较为成功，转化后的大肠杆菌能够在卡那霉素培养基上成长，活化后的大肠杆菌菌液进行SDS-page电泳也可看到较宽的条带，共培养及纸层析茚三酮变为紫色，证明转化后的大肠杆菌能够生成D-氨基酰化酶，并且D-氨基酰化酶存在活性。

关键字：D-色氨酸、D-氨基酰化酶、基因工程

Expression and application of D-aminoacylase

Abstract：

As a kind of non natural amino acids, D-amino acids not only has many functions of natural amino , but also has many properties which non natural amino acids do not have. D-amino is widely used in food, medicine in agriculture. D- tryptophan ,one of D-amino,plays an important role in the growth and development of human and animal, in the food and feed industry as well as in agriculture .

In this paper, using the technique of gene engineering derived from Streptomyces coelicolor to build a plasmid pET-30a-c( ),then translate into E.coli BL21. Activation the strains by use IPTG, then use SDS-PAGE electrophoresis detection of D- amino acyl enzyme in Escherichia coli expression. After that, Paper chromatography to test D-aminoacylase Whether it is activity.

This test is successful. After transformation E.coli can be seen in Kanamycin training base SDS-page also show the mark of protein .activity. Paper chromatography test D-aminoacylase is activity.

Keyword：D-Tryptophan、D-aminoacylase、gene engineering

第一章文献综述：

1.1、概述：

D-色氨酸是一种非蛋白活性氨基酸，在医疗农业等领域具有重要作用。目前合成D-氨基酸的方法主要是利用D-氨基酰化酶将DL-氨基酸拆分得到D-氨基酸。国内现在关于D-氨基酰化酶多应用于D-苯丙氨酸、D-蛋氨酸的合成等，但很少针对于生产D-色氨酸。课题利用来自天蓝色链霉菌Streptomyces coelicolor的D-氨基酰化酶(即N-acetyl- D-tryptophan deacylase)基因，构建表达该基因的大肠杆菌工程菌，并使用该工程菌实现对D,L-色氨酸的拆分。本文通过对氨基酰化酶的作用机理、应用进展、研究必要性以及对D-色氨酸的拆分作用等方面进行综述。

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