利用细胞和果蝇模型研究ATP13A2对溶酶体异常的影响

论文总字数：27721字

摘 要

目的：利用细胞和果蝇模型研究ATP13A2 N端对溶酶体异常的影响。

方法：1. 构建去除了N端胞质结构域的ATP13A2突变片段（Δloop），并连接到pcDNA3.1B( )上。分别将pcDNA3.1B( )，ATP13A2野生型质粒和ATP13A2 Δloop质粒转染入HEK293细胞中，48小时后收样并通过SDS-PAGE分离。使用M2抗体检测ATP13A2，β-actin作为内参。2. 分别将ATP13A2野生型质粒和ATP13A2 Δloop质粒转染入敲除了ATP13A2的MEF细胞中。溶酶体通过抗Lamp1抗体和相应的带荧光Cy3二抗进行标记，ATP13A2通过抗FLAG抗体和相应的带荧光Alexa 488二抗进行检测，使用共聚焦荧光显微镜拍照。3. 将ATP13A2 RNAi果蝇和Act5c-CD2-GAL4果蝇杂交。收集胚胎并热激30min，72小时后，对果蝇幼虫进行饥饿处理并解剖取其脂肪体。使用LysoTracker染色溶酶体，DAPI染色细胞核，使用共聚焦荧光显微镜拍照。

结果：1.ATP13A2 Δloop不能与溶酶体共定位，与转染了ATP13A2野生型质粒不同，过表达ATP13A2 Δloop质粒不能抑制在MEF细胞中敲除了ATP13A2后引起的早期溶酶体异常增多。2.ATP13A2 RNAi果蝇细胞与非重组细胞相比产生了更多的溶酶体。

结论：ATP13A2 N端胞质区对ATP13A2在溶酶体上的定位有重要作用。和人体内细胞一样，干扰果蝇体内ATP13A2同源基因后，溶酶体也会出现类似的表型。

关键词：ATP13A2，溶酶体，帕金森病，果蝇

Exploring Functional Roles of ATP13A2 on Lysosomes

in Both Cell and Drosophila Models

41112113 Jingyi Cui

Counselor：Zhuohua Zhang, Chunjie Zhao

Abstract

Objective: Dissecting ATP13A2 N-terminal function maintaining lysosome homeostasis in both cell and Drosophila models.

Methods: 1. Mutant ATP13A2 deleting the N-terminal cytosolic domain (Δloop) was subcloned into pcDNA3.1B( ). HEK293 cells were transfected with pcDNA3.1B( ), ATP13A2 WT or ATP13A2 Δloop, harvested after 48h and separated by SDS-PAGE. ATP13A2 was detected with M2 antibody and β-actin as a loading control. 2. ATP13A2 WT, or ATP13A2 Δloop was transfected into ATP13A2 knock out MEF cells. Lysosomes were probed with anti-Lamp1 antibody and relative secondary antibody with fluorophore Cy3. ATP13A2 was detected by anti-FLAG antibody and relative secondary antibody with fluorophore Alexa 488. Images were taken by confocal microscopy. 3. ATP13A2 RNAi was introduced into Act5c-CD2-GAL4. Embryos were collected and heat shocked for 30min. 72 hours later, starve the larvae for 6h and dissected out the fat body. Lysosomes were stained by lysotracker and the nuclei were detected by DAPI. Images were taken by confocal microscopy.

Results: 1. ATP13A2 Δloop is not colocalized with lysosome, and the early lysosome overproduction is not inhibited overexpressing ATP13A2 Δloop in ATP13A2 knock out MEF cells unlike cells transfected with ATP13A2 WT. 2. In ATP13A2 RNAi Drosophila clones, more lysosomes were produced compared with the unrecombinate cells.

Conclusion: N-terminal cytosolic domain is necessary for ATP13A2 lysosome membrane localization. RNAi Drosophila ATP13A2 homologue cause similar phenotype of lysosomes as in human cells.

KEY WORDS: ATP13A2, lysosome, Parkinson’s disease, Drosophila

目 录

摘 要 I

Abstract II

第一章 绪 论 1

1.1 引言 1

1.2 ATP13A2 2

1.3 溶酶体和自噬作用 2

1.4 果蝇遗传学 3

1.4.1 Balancer和Marker 3

1.4.2 果蝇基因的操作 3

1.5 本文的主要研究内容 5

第二章 免疫荧光观察转基因细胞内溶酶体异常 6

2.1 实验材料 6

2.1.1 细胞系 6

2.1.2 药品耗材 6

2.1.3 试剂溶液 6

2.1.4 仪器设备 7

2.2 实验方法 8

2.2.1 ATP13A2 Δloop质粒的构建 8

2.2.2 细胞的培养与转染 10

2.2.3 免疫印迹 10

2.2.4 免疫荧光 11

2.3 实验结果 11

2.3.1 琼脂糖电泳结果 11

2.3.2 免疫印迹结果 14

2.3.3 免疫荧光结果 14

2.4 分析与讨论 15

第三章 共聚焦显微镜观察转基因果蝇体内溶酶体异常 16

3.1 实验材料 16

3.1.1 果蝇品系 16

3.1.2 药品耗材 16

3.1.3 试剂溶液 16

3.1.4 仪器设备 16

3.2 实验方法 17

3.2.1 果蝇杂交及表型观察 17

3.2.2 果蝇卵的热激 17

3.2.3 果蝇脂肪体的分离 17

3.2.4 制片及共聚焦荧光显微镜的使用 19

3.3 实验结果 19

3.4 分析与讨论 20

结 论 22

致 谢 23

参考文献（References） 24

第一章 绪 论

1.1 引言

帕金森病（Parkinson's disease, PD），也被称为特发性或原发性帕金森病、运动减弱刚性综合征或震颤麻痹，是主要影响运动系统的中央神经系统退行性疾病^[1]。帕金森病的运动症状是由于中脑区域黑质中产生多巴胺的细胞死亡导致的，目前对这种细胞死亡的原因还不清楚。在疾病的早期过程中，最明显的症状是和运动相关的，包括颤抖、肌肉强直、行动缓慢以及步态动作困难，之后的思维和行为可能会出现问题，晚期经常会出现痴呆症状，抑郁也是最常见的晚期症状，其他的症状包括感觉、睡眠和情绪问题。帕金森病在老年人中比较常见，大部分发生在50岁以上的老年人中，但也有青年型帕金森。

帕金森病可以是原发性或继发性的，原发性帕金森病又被称为特发性（即不清楚导致的原因）帕金森病，但也有一些非典型的病例具有遗传的原因，而继发性帕金森病是由已知的原因导致的，比如毒素。该疾病的病理学特征为神经元中路易小体（Lewy Body, LB）内蛋白质的聚积，以及中脑某些部位形成了活性不充分的多巴胺^[1]。

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