论文总字数：29443字

摘 要

Abstract Ⅱ

第一章 绪论 1

1.1 lncRNA研究现况 1

1.2 lncRNA与B淋巴细胞的关系 3

第二章 实验材料和方法 5

2.1 取小鼠B细胞 5

2.2 B细胞纯化和培养 5

2.3 LncRNA-139的生物学分析 6

2.4 慢病毒感染及敲降效率检测 7

2.5 B细胞磁珠分选 7

2.6 检测LncRNA-139对B淋巴细胞生长发育的影响 8

2.6.1 检测LncRNA-139对B细胞活化的影响 8

2.6.2 检测LncRNA-139对B细胞增殖的影响 8

2.6.3 检测LncRNA-139对B细胞凋亡的影响 9

2.6.4 检测LncRNA-139对B细胞相关免疫球蛋白表达和转录因子的影响 10

第三章 实验结果 11

3.1 B细胞的流式分选 11

3.1.1 造血干细胞的流式分选 11

3.1.2 骨髓B细胞的流式分选 12

3.1.3 脾脏B细胞的流式分选 13

3.2 LncRNA-139在B细胞不同发育阶段的表达量 13

3.3 慢病毒感染的敲降效率 14

3.4 LncRNA-139对体外B细胞生长发育的影响 14

3.4.1 LncRNA-139对B细胞活化的影响 14

3.4.2 LncRNA-139对B细胞增殖的影响 16

3.4.3 LncRNA-139对B细胞凋亡的影响 17

3.4.4 LncRNA-139对IgD、IgM和相关转录因子Blimp-1表达量的影响 17

结论 19

参考文献 21

致 谢 23

摘 要

LncRNA作为现如今的研究热点，其在B细胞发育过程中起到的影响和相应的分子调节机制还有待进一步阐明。实验选取特定的非编码RNA lncRNA-139，检测lncRNA-139对B淋巴细胞生长发育及其功能的影响。实验用流式细胞仪流式分选了B淋巴细胞：造血干细胞、Pre-B细胞、Pro-B细胞、未成熟B细胞和成熟B细胞，并确定了lncRNA-139在五种B淋巴细胞中的表达量，发现lncRNA-139在早期细胞发育中呈上升趋势，在Pro-B细胞，未成熟B细胞和成熟B细胞中基本保持不变。接着实验在体外用慢病毒感染shRNA的方式敲降了B淋巴细胞中的lncRNA-139，敲降效率为60%以上，我们用敲降后的B淋巴细胞作为实验组和未经敲降的B淋巴细胞作对照，在LPS溶液的刺激下，添加不同荧光标记的Ab，用流式细胞术和qPCR等方法检测lncRNA-139的敲降对B淋巴细胞活化、增殖、凋亡等细胞生长情况产生的影响。实验结果表明，在没有LPS溶液的刺激下，lncRNA-139的敲降对B淋巴细胞活化没有影响。而在LPS溶液的刺激下，lncRNA-139的敲降会使得B细胞表面的两种细胞分子CD86、CD69会发生下调，降低B淋巴细胞的活化程度。lncRNA-139D的敲降还能抑制B细胞的增殖，并诱导B细胞的凋亡。此外，lncRNA-139的敲降还会引起B淋巴细胞分泌抗体蛋白的减少，表现在免疫球蛋白IgD、IgM表达量的降低以及相关转录因子Blimp-1的降低上。实验结果表明，lncRNA-139参与B淋巴细胞的生长发育，对B淋巴细胞的功能有一定影响。

关键词：lncRNA，B淋巴细胞，B细胞的生长发育，流式细胞分选

Abstract

As a hotspot of research today, LncRNA plays an important role in the development of B-cells and the corresponding molecular regulation mechanism. The specific non-coding RNA lncRNA-139 was selected to detect the effect of lncRNA-139 on the growth and function of B lymphocytes. The experiment used flow cytometry to sort B lymphocytes: hematopoietic stem cells, Pre-B cells, Pro-B cells, immature B cells and mature B cells, and identified lncRNA-139 in five B lymphocytes. The expression level of lncRNA-139 was found to be on the rise in early cell development, and remained essentially unchanged in Pro-B cells, immature B cells and mature B cells. Then we knocked down lncRNA-139 in B lymphocytes with lentivirus in vitro, and the knockdown efficiency was more than 60%. We used knockdown B lymphocytes as the experimental group and normal B lymphocytes were used as controls. Under the stimulation of LPS solution, different fluorescently labeled Abs were added. Flow cytometry and qPCR were used to detect the activation, proliferation and apoptosis of B lymphocytes. The experimental results showed that knockdown of lncRNA-139 had no effect on B lymphocyte activation without stimulation of LPS solution. Under the stimulation of LPS solution, the knockdown of lncRNA-139 caused the down-regulation of two cell molecules CD86 and CD69 on the surface of B cells, which reduced the activation of B lymphocytes. Knockdown of lncRNA-139D also inhibited B cell proliferation and induced B cell apoptosis. In addition, knockdown of lncRNA-139 also caused the decrease in the secretion of antibody protein in B lymphocytes, such as immunoglobulin IgD, IgM and the related transcription factor Blimp-1. The experimental results show that lncRNA-139 is involved in the growth and development of B lymphocytes and has an effect on the function of B lymphocytes.

KEY WORDS: lncRNA, B lymphocytes, the development of B-cells, flow cytometry

绪论

lncRNA研究现况

除了能编码蛋白质的蛋白序列，还有大部分基因序列不具有直接编码蛋白分子的功能，我们称这部分序列为非编码序列。非编码序列在上个世纪70年代初就得到了学术界的广泛关注，科学家们猜测非编码序列具有除去编码蛋白质以外的特殊生物学功能。如今针对非编码序列国内外学者已展开了大量研究，证实其能通过和相关分子相互作用，调控细胞内外的分子表达。长非编码RNA（lncRNA）作为非编码序列中的一大研究热点，已成为细胞增殖分化、细胞衰老和癌变的重要研究工具。典型的lncRNA长度不小于200个核苷酸单位，并具有和mRNA相似的结构：5'帽和3'多腺苷酸化（poly（A））尾[1]，但缺乏进化上的保守性。虽然lncRNA不具有编码蛋白的能力，但其可以和DNA、miRNA、蛋白质等分子相互作用，通过多种信号分子调控通路，在转录、转录后和蛋白质水平上发挥相应的作用，影响一系列细胞活动，例如：细胞增殖分化、DNA损伤引起的细胞凋亡、细胞迁移侵袭、自噬等等。此外，lncRNA在医学领域也已表现出了独特的临床意义，高的组织特异性和细胞特异性使lncRNA能作为生物标志物、预后因子或特殊治疗靶点，其异常表达在肿瘤细胞生物学中具有潜在的研究价值。[2]

剩余内容已隐藏，请支付后下载全文，论文总字数：29443字