APEC E2株ssrA基因对于耐药性的影响

论文总字数：12215字

摘 要

禽致病性大肠杆菌（avian pathogenic E.coli , APEC )属于肠道外致病性大肠杆菌（ExPEC），寄生在人和温血动物的肠道外，能够引起禽的局部或全身感染性疾病，是引起禽类高死亡率的重要传染病之一。目前已发现APEC有多种致病因子，如P菌毛，I型菌毛，脂多糖复合物，荚膜，铁摄取系统等。ssrA基因是GI22基因组岛的整合位点，可以和其邻近基因smpB组成tmRNA-smpB系统。本实验构建了大肠杆菌E2株的ssrA基因的缺失株，对于野生型和突变株进行药敏试验，探讨ssrA基因对于大肠杆菌耐药性的影响，结果证实ssrA基因突变后会影响到细菌对氯霉素和四环素抗性的改变。

关键词：禽致病性大肠杆菌（APEC），ssrA基因，突变株，耐药性

Abstract：Avian pathogenic E.coli (APEC) belongs to the extra-intestinal pathogenic E. coli (ExPEC). It is parasited outside the intestines of warm-blooded animals. It is one of the most important partial and systemic infectious disease that can cause high mortality in poµLtry. A variety of pathogenic factors have been found in APEC, such as P pilus, type I pilus, lipopolysaccharide complexes, capsule, and iron uptake systems. The ssrA gene is combined with its neighboring gene smpB to constitute the tmRNA-smpB system. In this experiment, we first constructed the deletion of ssrA gene of E.coli strain E2, and then investigated the effect of ssrA gene on E.coli resistance by antimicrobial susceptibility test of wild-type and mutant strains. Results showed the difference between mutant strains and wild strains were resistance to tetracycline.

Key Word： avian pathogenic E.coli (APEC), ssrA gene, mutant strain, antibiotic resistance

目录

1 前言 4

2 材料 4

2.1 菌株 4

2.2 主要试剂及配制方法 5

2.3 使用仪器及用途 6

2.4 其他 7

3 实验方法 7

3.1突变株的构建 7

3.1.1 E2的复苏及DNA的提取 7

3.1.2 PCR反应 8

3.1.3产物的回收 9

3.1.4感受态细胞DH5α的制备 9

3.1.5目的基因片段ssrA1-cat-ssrA2片段的克隆测序 9

3.1.6电转化感受态细胞E2的制备 10

3.1.7 质粒pKD46的转化（一次电转） 10

3.1.8 Red重组功能的诱导和感受态细胞的制备 11

3.1.9电转化构建突变株（二次电转） 11

3.1.10质粒pKD46的消除 11

3.2 野生型E2和E2ΔssrA耐药性检测 12

3.3保存菌种为后续实验做准备 12

4 实验结果 13

4.1目的片段ssrA1-pKD3-ssrA2获得 13

4.2 一次电转结果（质粒pKD46的转化） 14

4.3 突变株构建结果 14

4.4 APEC E2突变株的获得 14

4.5 药敏实验结果 15

5.讨论 16

参考文献 17

致 谢 19

附录 20

1 前言

大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)是一种寄生在人和动物大肠内的正常菌群，属于革兰氏阴性短杆菌，大部分为非致病性菌株，少数致病。本实验研究的对象禽致病性大肠杆菌（APEC）属于肠道外致病性大肠杆菌（ExPEC）,是一种定植于肠道外能够引起禽的局部或全身感染性疾病，并导致禽类高死亡率的重要长染病之一^[1]。目前已发现I型菌毛^[2,3]，侵袭因子IbeA^[4]，铁摄取系统^[2,5]等是引起APEC致病的原因。

ssrA或10Sa RNA,即转录-信使RNA（tmRNA）是一个小而稳定的RNA分子^[6]。由160个氨基酸残基组成的转录-信使RNA-小蛋白（SmpB），可介导细菌翻译的控制系统---反式翻译系统^[7]。它可以特异性紧密结合由ssrA基因编码的tmRNA并与其组成复合体，该复合体系统可以修饰并降解一些问题蛋白^[8-12]。研究表明，破坏ssrA基因可以使APEC E2的致病力明显降低。

本实验运用基因重组方法构建ssrA单基因缺失突变株。PCR扩增目的基因ssrA1-cat-ssrA2并将其插入转化克隆测序，筛选正确的抗性片段，电转化入已携带温度敏感型质粒pkd46的APEC E2中，根据同源重组原理，筛选出ssrA突变株E2△ssrA::cat。采用药敏试验的方法，利用纸片扩散法比较APEC E2野生型菌株以及ssrA突变株E2△ssrA::cat对青霉素等19种抗生素的耐药性，从而进一步分析出APEC E2株ssrA基因对于耐药性的影响。

2 材料

2.1 菌株

本实验使用的菌株APEC E2是由本实验室保存的大肠杆菌的野生菌株，大肠杆菌突变株E2ΔssrA由本实验室构建和保存。

表1 本实验中使用的菌株及质粒

2.2 主要试剂及配制方法

表2 本实验中使用的试剂

试剂	配方	用途
LB液体（固体）培养基（200ml）	YEAST EXTRACT 1g	复苏及扩增大肠杆菌
	TRYPTONE 2g
	NaCl 1g
	（琼脂）
Mueller-Hinton（MH）培养基 （进口）	称取本品8.4g,加热溶解于200ml蒸馏水中,121℃高压灭菌30分钟,待冷至40-50℃，倾入无菌平皿,备用。	培养细菌，为后续进行药敏试验做准备
提质粒P1	C6H12O6 50mM	除去RNA，储存于4°
	Tris-Hcl 25mM
	EDTA（PH8.0） 10mM
提质粒P2	NaOH 0.2M	裂解细胞
	SDS 1%
提质粒P3	醋酸钾5M 300ml	沉淀DNA
	冰醋酸 57.5µL
	加ddH2O至500ml
1xTAE	Tris-Hcl 5.5g/L	DNA或RNA进行凝胶电泳时的缓冲液
	硼酸 2.75g/L
	EDTA 1mol/L
Ampicillin	1g本品 8mlddH2O，充分混合溶解后定容至10ml。 0.22um滤膜过滤除菌，分装后置于-20°保存。	抗生素
Chloramphenico	足量的无水乙醇溶解0.5g氯霉素，定容至10ml,分装后置于-20°保存。	抗生素
5×KCM buffer	KCl 0.5M	缓冲液，可提高转化效率
	Cacl2 0.15M
	Mgcl2 0.25M

2.3 使用仪器及用途

本实验使用的仪器见表3。

表3 本实验中使用的仪器

仪器	生产公司	型号	用途
PCR仪	ABI	GeneAmp PCR System 9700	体外扩增DNA
电泳仪	北京市六一仪器厂	DYY-6C	分离DNA
凝胶成像系统	伯乐	Gel DOX XR System	定性分析蛋白质，核酸，多肽，氨基酸等生物大分子的分离纯化结果
全温度恒温培养箱	苏坤	SKY-200B	培养细菌
灭菌锅	ALP	ALPMC-30S	对实验器材进行消毒灭菌
小型离心机	eppendorf	Centrifuge 5418	分离DNA和其他物质
台式高速冷冻离心机	eppendorf	Centrifuge 5810R
电热恒温振荡水槽	上海精宏实验设备有限公司	DKZ-1	切胶回收时溶解Buffer DE-A;加热去离子水以提高洗脱效率等
电磁炉	尚朋堂	SR1603-A	裂解DNA
超低温冰箱	Haier（海尔）	L286	冻存菌种
电转化仪	宁波新芝生物科技股份有限公司		将ssrA1-cat-ssrA2基因电转化入已携带温度敏感型质粒pkd46的APEC E2中
酶标仪		infiniteM200 PRO	测定菌液浓度

2.4 其他

本实验使用的引物由赛百盛公司合成，引物合成相关序列如下。

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