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摘 要

大肠埃希菌在人和动物肠道中大量存在，是引起泌尿外科尿路感染的常见的革兰氏阴性杆菌。本实验研究了44株来源不同的大肠埃希菌，通过PCR扩增管家基因片段，测得序列后进行MLST多位点序列分型分析。通过MLST数据库对比，共获得26个已知的ST型，发现4个新的ST型，一个ST型最多拥有5株菌，有19株菌拥有独立的ST型，这表明分离的大肠埃希菌基因型发生了进化。系统发育树将这些大肠埃希菌分为两个组，在树的末端发现了15对高同源性基因，且只有两对基因位于进化距离较远的分支上。这些结果为进一步研究大肠埃希菌奠定了基础。

关键词：大肠埃希菌，PCR，多位点序列分析，MLST

Abstract: Escherichia coli is a common gram-negative bacterium that causes urinary tract infection in urology, and is abundant in human and animal intestines. In this experiment,44 strains of Escherichia coli from different sources were studied. PCR was used to amplify housekeeping gene fragments, and MLST typing was carried out after the sequences were measured. By comparing MLST databases, a total of 26 known ST types were obtained and 4 new ST types were found. One ST type had 5 strains at most and 19 strains had independent ST types, which indicated that the genotype of isolated Escherichia coli has evolved. Phylogenetic tree divides these Escherichia coli into two groups. Fifteen pairs of highly homologous genes were found at the end of the tree,

and only two pairs of genes were located in the branches with far evolutionary distance. These results lay a foundation for further study of Escherichia coli.

Key words: Escherichia coli, PCR, Multilocus sequence typing, MLST

目 录

1前言 4

2 材料与方法 5

2.1 材料与方法 5

2.1.1 菌株 5

2.1.2 主要仪器与试剂 6

2.1.3 引物 6

2.2 方法 8

2.2.1 菌株分离 8

2.2.2 模板制作 8

2.2.3 PCR扩增 8

2.2.4 产物测序 8

2.2.5 MLST分型分析 8

2.2.6 系统发育树分析 9

3 结果与分析 9

3.1 PCR扩增和测序 9

3.2 MLST分型分析 10

3.3 系统发育树分析 12

讨论 14

参考文献 16

致谢 18

1前言

大肠埃希菌 (Escherichia coli)，俗称大肠杆菌，是人类和动物肠道中的大量正常栖息的细菌。大肠杆菌是一种大小为0.5×1-3微米的革兰氏阴性杆菌。它全身都有鞭毛，没有芽也能移动。它还能发酵各种糖来产生酸和气体。它的病原体之一是血浆凝固酶。致病性大肠杆菌根据其致病性可分为五种类型:产肠毒素性大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌、肠致病性大肠杆菌、肠粘附性大肠杆菌和肠出血性大肠杆菌。一些大肠杆菌菌株甚至会导致成人腹泻或食物中毒。

中国有大肠杆菌引起食物中毒的报道。潜伏期最短为3小时，最长为33小时，平均为18小时。主要症状为发热37.5℃-38.5℃、腹痛、腹泻和头痛，伴有恶心和呕吐。腹泻是类似水的腹泻，通常2-3次，最多9次,经过抗菌素治疗2-3天后全部痊愈。这些由致病性大肠杆菌引起的食物中毒经流行病学调查、临床资料分析和实验室检测结果证实。

大肠杆菌O157是严重危害人类健康的肠出血性大肠杆菌的主要血清群。该菌可引起出血性腹泻和肠炎、溶血性尿毒综合征、血栓性血小板减少性紫癜等，可严重导致死亡。这种细菌是出血性大肠杆菌的致病血清型，主要侵入小肠的远端和结肠。目前，多个国家已将“O157”列为必须报告的传染病，予以高度重视。为防止大肠埃希菌O157感染事件的发生，我国于1997年五月建立了全国性的监测网络，2000年卫生部将大肠埃希菌O157列为重点检测对象。各种熟肉制品、冷却肉、牛肉和生奶是最常见的食物中毒食品，其次是鸡蛋和蛋制品、奶酪和蔬菜、水果、饮料等食物。主要的中毒原因是这些食品本身极具已收到污染，且在食用前未经彻底加热，中毒多发生在3、9月。

另外，大肠埃希菌是泌尿感染的主要病原体，也是最常见的病原体。所有尿路感染的门诊病人中有90 %的比例其病原体都是大肠埃希菌^[1]。且尿路感染的发病率非常高，经济负担也相当大：几乎有一半的妇女一生中至少经历过一次泌尿感染；2000年美国妇女泌尿感染治疗的总支出约为24.7亿美元^[2，3]。在美国，泌尿致病性大肠埃希菌的耐药性持续上升，给泌尿感染的治疗带来了更大的困难和阻碍^[4，5]。Manges^[6]等人2001年报道了大肠杆菌的单克隆群，并将其命名为克隆群A（CgA），基于特征性肠细菌重复基因间一致性( ERIC2 )聚合酶链式反应（PCR）图谱，这些单克隆大肠杆菌群是自1999年10月至2000年1月间在加利福尼亚大学健康诊所诊断出的47名尿路感染妇女的甲氧苄啶甲噁唑耐药大肠杆菌分离株的主要来源。此外，还发现属于CgA的人类泌尿感染分离物具有随机扩增的多态性DNA聚合酶链式反应、毒力因子谱、相似的抗微生物表型、O抗原组( O11、O17、O73和O77 )和不可区分或密切相关的脉冲场凝胶电泳( PFGE )模式^[7]。2005年左右，有科学家们设计了一种基因特异性聚合酶链式反应PCR，基于在fumC管家基因^[8]中鉴定的SNP分子标记(SNP)(C288T)来鉴定CgA。

病原体的基因型特征已成为传染源流行病学调查的一个重要目标。常用的脉冲场凝胶电泳多用于传染病的爆发调查，而对菌株的遗传进化特征分析并不适用；多位点序列分型对菌株的进化关系及微生物群体遗传学分析更加适用，因此，一般将其用于广义的流行病学研究^[9,10]。

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