紫萍GS1-1基因cDNA的克隆与测序

论文总字数：10411字

摘 要

浮萍亚科是泽泻目天南星科的一个亚科，包含有5属，37种。此亚科的植物通称为浮萍。紫萍（Spirodela polyrrhiza）又名水萍，为天南星科紫萍属下的一个种。紫萍在全球均有分布，主要集中在温带及热带地区。在池塘，稻田，河面上常有浮萍生长。由于浮萍生长周期快，易培养，体积小并且能够富集氮磷等营养元素，所以作为实验室研究污水处理和相关蛋白基因的材料相对方便。由以往研究材料显示，浮萍主要通过吸收污水中的含氮离子达到污水脱氮的效果。浮萍通过吸收得到的NH₄ 绝大多数通过谷氨酰胺合成酶/谷氨酸合成酶循环在植物体内同化利用。本研究以实验室培养的紫萍提取的总RNA通过试剂盒制备的cDNA为模板，通过基因克隆的手段获得紫萍15号染色体上GS1基因的cDNA序列并转入大肠杆菌中，并完成其cDNA的测序，为后期研究在不同氮素下培养浮萍GS1基因的表达量差异做准备。

关键词：浮萍，谷氨酰胺合成酶，基因克隆

Abstract：Duckweed subfamily is a subfamily of Araceae of Alismatidae, which includes 5 genera and 37 species. The plants of this subfamily are commonly known as duckweeds. Spirodela polyrrhiza, is a species belonging to the genus of Lemnaceae. S. polyrrhiza is a kind of floating plant distributed in temperate and tropical regions of the world. It grows in still water like in ponds, paddy fields, ponds and rivers. It often forms a floating plant community covering the water surface with Lemna minor. Because duckweed has fast growth cycle, easy cultivation, small size and can enrich nutrients such as nitrogen and phosphorus, it is relatively convenient to study sewage treatment and related protein genes in the laboratory. Previous research materials show that duckweed mainly achieves the effect of nitrogen removal by absorbing nitrogen ions in sewage. The majority of NH₄ absorbed by duckweed is assimilated and utilized in plants through glutamine synthase/glutamate synthase cycle. In this study, the cDNA sequence of GS1 gene on chromosome 15 of S. polyrrhiza was amplified using its cDNA library as the template and cloned in pMD19-T, which was then transformed into Escherichia coli. Its cDNA wad then sequenced. This study is to prepare for the later study on the difference of GS1 gene expression under different nutritional conditions.

Keywords：duckweed, glutamine synthase, gene cloning

目 录

1 前言 4

2 实验材料 5

3 实验试剂 6

4 实验仪器 6

5 实验方法 6

5.1 试剂盒提取紫萍总RNA 6

5.2 试剂盒合成cDNA第一条链 6

5.3 GS1-1基因cDNA的扩增 7

5.4 感受态细胞的制备与培养 7

5.5 GS1-1基因克隆片段的连接与转化 8

5.6 阳性菌的检测 8

5.7 琼脂糖凝胶电泳 8

6 实验结果与分析 8

6.1 GS1-1基因cDNA扩增结果分析 9

6.2 感受态大肠杆菌转化与培养结果分析 9

6.3 阳性菌检测结果与分析 10

6.4 测序结果与分析 10

7 qPCR引物设计 11

结 论 13

参 考 文 献 14

致 谢 15

1 前言

紫萍（Spirodela polyrrhiza）是一种单子叶植物纲、浮萍科、紫萍属水生草本，漂浮水面。叶状体倒卵状圆形，花单性，果实圆形，有翅缘，花期6～7月[1]。紫萍分布于全球各温带及热带地区，生长于池沼，稻田，水塘及静水的河面，常与青萍（Lemna minor）形成覆盖水面的飘浮植物群落[1]。紫萍在我国早期常做药用，全草可入药，具有清热消肿之效。而且由于紫萍生长周期快，易获取，营养价值高，还常被用作饲料培植。近期相关研究发现，紫萍的提取物还具有抗氧化作用。

水体污染是指由于水体内氮磷等营养元素大量累计而导致的水体富营养化致使水体变脏变差。近年来由于人类不规范行为所造成的水体污染日趋严重。水体富营养化不仅会影响水质，而且会严重破坏生态系统的平衡。此外，因富营养化水中含有硝酸盐和亚硝酸盐，如果此类污水没有适当处理而过量饮用，甚至会威胁人畜的生命健康。

而大量研究表明浮萍脱氮效果显著，浮萍可通过直接吸收水体中的氮素或间接影响水体的理化性质与微环境对污水进行脱氮[2]。有研究认为直接吸收是浮萍脱氮的主要途径，吸收量可占总氮去除量的 10%～30% [3]。基于其高效的氮磷富集作用，浮萍被广泛应用于污水治理[4]。

紫萍内绝大部分的 NH₄ 通过 GS/GOGAT (谷氨酰胺合成酶/ 谷氨酸合成酶)循环同化。在绿色组织中，GS/GOGAT 循环的主要作用是同化光呼吸产生的 NH₄ 以及硝酸盐在叶中还原产生的 NH₄ [5]。该循环中，通过细胞膜上转运蛋白转入细胞质的 NH₄ 和谷氨酸首先由 GS 催化合成谷氨酰胺，然后由在叶绿体内由 GOGAT 将谷氨酰胺和α-戊二酸转变为 2 个分子谷氨酸，其中一个分子谷氨酸可作为 GS 的底物，另一个分子谷氨酸可用于合成蛋白质、核酸等含氮化合物[6]，如图1。

目前已发现高等植物 GS 至少有2种形式，即细胞质 GS(GS1)和质体GS(GS2)[7]，GS2 主要存在于叶绿体基质中，为绿色组织的主要 GS 形式，而 GS1 主要存在于非光合组织内，为非光合组织 GS 的主要形式[8]。GS1 由一个小的核多基因家族编码，而 GS2 由单个核基因编码[9]。GS 为八聚体，由一或两条多肽构成，分子量依植物而异[10]。

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