论文总字数：12384字

摘 要

由于生境特殊、价格昂贵和过度采挖，野生冬虫夏草资源已经濒临枯竭，加上其人工栽培的难度较大，因此其替代品的研究越来越受到各界人士的关注。为此，参照蚕幼虫培育蛹虫草的技术，通过单因素试验，比较了不同的前处理方式、接种方式及出草包埋介质的处理，探索使用大麦虫幼虫培育大麦虫虫草的条件。结果表明，通过高温处理大麦虫幼虫，并以喷淋的方式进行接种，可以将僵化率提高至100％，采用复合土包埋出草，可使单一子座率达到81.4％。研究结果的应用可以为深度开发大麦虫产业开辟一条新途径。

关键词：大麦虫，蛹虫草，大麦虫虫草，人工培育

Abstract：Due to the special habitat, high price and over-excavation, the wild cordyceps resources are already on the verge of exhaustion, and its artificial cultivation is more difficult. Therefore, the research on its substitutes has attracted more and more attention from all walks of life. To this end, with reference to the technique of cultivating cordyceps militaris by silkworm larvae, different pretreatment methods, inoculation methods and treatment of grass-embedded medium were compared by single factor test, and the conditions for the cultivating of barley cordyceps with barley larvae. The results showed that the sterilization of barley larvae by high temperature treatment and inoculation by spraying can increase the rigidity to 100%, and embed the barley larvae grass with peat soil which can achieve a single atroma rate of 81.4% . The application of the research results can open up a new way for the deep development of the barley worm industry.

Keywords：Barley worm, Cordyceps militaris, Barley cordyceps, Artificial cultivation

目 录

1 概述 1

1.1 蛹虫草概述 1

1.1.1 蛹虫草背景 1

1.1.2 蛹虫草成分与功效 1

1.2大麦虫虫草概述 2

1.2.1大麦虫背景 2

1.2.2大麦虫虫草简介 2

2材料与配方 2

2.1菌种 2

2.2培养基和包埋介质制备 3

2.2.1固体培养基配制 3

2.2.2液体培养基配制 3

2.2.3复合土包埋介质制备 3

2.2.4麦麸包埋介质制备 3

2.2.5琼脂包埋介质制备 3

2.2.6主要仪器设备 3

2.2.7其他准备 4

2.3试验方法 4

2.3.1菌种分离 4

2.3.2菌种培养 4

2.3.3接种方式的试验 4

2.3.4大麦虫幼虫处理方式的单因素试验 5

2.3.5栽培管理 5

3结果分析 6

3.1不同接种方式对侵染率的影响 6

3.2幼虫接种前不同消毒方式对侵染率的影响 8

3.3不同包埋基质对出草形态的影响 8

3.4复合土包埋大麦虫虫草生物学性状 10

结论 11

参考文献 12

致 谢 15

1 概述

1.1 蛹虫草概述

1.1.1 蛹虫草背景

蛹虫草(Cordyceps militaris)又名北冬虫夏草，简称北虫草，隶属子囊菌亚门(Ascomycotina)，核菌纲(Pyrenomycetes)，肉座菌目(Hypocreales)，麦角菌科(Clavicipitaceae)，虫草属(Cordyceps)^[1]。现阶段，冬虫夏草的市场的需求量很大，销售量迅速增加。由于生长环境特殊、过度采挖和价格昂贵，野生冬虫夏草资源已经面临枯竭，加上其人工栽培的难度大，因此其替代品的研究越来越受到各界人士的关注。蛹虫草与冬虫夏草成分相似，甚至前者虫草素等活性成分远高于后者^[2~5]。中国医学科学院药物研究分析室、中国科学院沈阳分院理化测试中心等部门的检测结果表明，蛹虫草含有的活性成分虫草素、虫草酸、虫草多糖和18种氨基酸均高于冬虫夏草^[6]，可作为冬虫夏草的替代品应用于食品及制药、制酒等多种行业，市场增长空间巨大^[7]。

1.1.2 蛹虫草成分与功效

野生的蛹虫草最早记载于《新华本草纲要》^[8]，现代中医学巨著《中华药海》也有记载^[9]，除此之外，《全国中药汇编》:“蛹虫草(北虫草)的子实体及虫体也可作为冬虫夏草入药”^[10]。蛹虫草与冬虫夏草为同一属的真菌，化学成分相似。中医认为，虫草是唯一一种既能调节、平衡阴阳的药材。

蛹虫草的有效成分主要为虫草素、虫草酸、虫草多糖、腺苷等。

虫草素是蛹虫草的主要生物活性成分之一，具备抗肿瘤、调节免疫力、抑菌、抗炎等功效。在抗肿瘤方面，虫草素能有效抑制小鼠肝癌、白血病、宫颈癌等多种肿瘤细胞的生长增殖。张莉莉^[11]等证明随着虫草素剂量的增加，虫草素对H22细胞的抑制率逐渐增长，而且虫草素能明显改善因荷瘤而导致小鼠体质异常情况，增强机体的免疫功能。虫草素可以通过诱导产生活性氧自由基，线粒体功能紊乱，激活caspase及引起多聚(ADP-核糖)聚合酶发生剪切作用而导致白血病细胞的凋亡^[12]。此外，虫草素可以使Hela细胞的细胞分裂周期停滞于G₂/M期^[13]。

虫草酸就是D-甘露醇，又叫D-甘露糖醇。虫草酸具有促进新陈代谢、抗氧化、利尿等功能，临床主要应用于治疗脑血栓、肾功能衰竭等^[14-15]，还可以治疗心脑血管疾病，能够清除自由基、扩张血管、降低血压等^[16]。

虫草多糖是高分子复合物多糖，具有抗肿瘤作用，同时具有抗氧化、抗衰老、降血糖、抗凝血、降血脂、护肝护肾等作用^[17-18]。蛹虫草的提取物中含有虫草多糖、氨基酸、SOD等物质，能使人体血乳酸含量降低，血清睾酮含量明显提高，皮质醇降低，迅速恢复机体生理状态^[19]。张明^[20]等用醇沉得到的蛹虫草多糖喂食果蝇，发现蛹虫草多糖具有延长果蝇寿命的作用，并且能够提高雌果蝇的SOD活力，有明显的抗氧化功效。孟兆丽等^[21]的抗氧化实验显示蛹虫草多糖具有清除羟自由基和氧自由基的能力。虫草多糖可抑制肿瘤基因的表达，Yang等^[22]研究了虫草胞外多糖对B16黑色素瘤荷瘤小鼠的肿瘤抑制能力，结果表明虫草多糖在某种程度上可抑制肿瘤细胞的生长。

1.2大麦虫虫草概述

1.2.1大麦虫背景

大麦虫(Zophob asatratus Fab.)，隶属于属昆虫纲(Insecta)，鞘翅目(Coleoptera)，拟步甲科(Tenebrionidae)，拟步甲族(Tenebrionini)，主要分布于南美洲地区，又称超级面包虫^[23-25]。是我国近几十年引进的新型蛋白源昆虫。有研究表明，大麦虫幼虫蛋白质含量（54.97 g/100 g）高于鸡蛋、大豆和牛奶，是优质的动物蛋白来源，并且必需氨基酸含量高于牛肉和全脂奶粉。冯金华等^[26]测定了大麦虫幼虫中脂肪酸的组成，共确认了27种脂肪酸成分，表明大麦虫幼虫油脂具有巨大的研究和利用价值。因此深入研究大麦虫的利用价值具有很高的经济价值和开发潜力。大麦虫是一种可食用的安全性食品，H.B.Freye等^[27]对取食以及接触大麦虫安全性进行了研究与验证，试验结果没有出现对大麦虫过敏反应的报道。

1.2.2大麦虫虫草简介

使用大麦虫幼虫作为寄主来培育蛹虫草方面的研究少之又少，且文章描述较模糊，小组希望能够得到更加准确的培育大麦虫虫草的方法，故而进行了深入研究研究。蛹虫草的寄主范围包括鳞翅目、鞘翅目及双翅目等昆虫的蛹、成虫或幼虫^[28]，所以培育大麦虫虫草的方案是可行的。以大麦虫幼虫为宿主的北虫草子实体融合了“虫”与“草”的丰富营养与功效。其外观与野生冬虫夏草十分相似，包括大麦虫幼虫和生长于幼虫头或胸部的长度大于3 cm的单一虫草子座。由于昆虫幼虫体内杂菌较多，一般蛹虫草菌很难成功感染^[29]。为了能够使蛹虫草能够顺利感染幼虫，小组经过大量的虫体前处理、接种方式和出草管理方面的试验，总结得出从感染到出草管理的最优方案。

2材料与配方

2.1菌种

菌种为淮阴师范学院资源微生物研究所虫草课题组提供。大麦虫购于洛阳银通虫业养殖公司。

2.2培养基和包埋介质制备

2.2.1固体培养基配制

先将新鲜马铃薯清洗干净，去皮，称取200 g切成均匀的片状，锅中加1 L水煮沸15 min左右，煮至能用玻璃棒戳破即可。用洁净的4层纱布过滤，将滤过液倒入洗净的锅中，然后加入称好的20 g琼脂，小火加热搅拌至全部溶化，大火容易糊底。再加入称好的葡萄糖20 g并搅拌均匀。加水定容至1 L，趁热分装入试管，每支装入量约为试管容积的1/4。分装完毕，试管塞入硅胶塞（或者棉塞），塞硅胶塞前将试管口的溶液清除干净，以免造成污染。最后将每7支试管扎成一捆，用报纸包好扎紧。0.12 MPa、121 ℃高温灭菌20 min，并趁热摆成斜面。斜面放入培养箱培养3 d，确认没有杂菌污染，进行菌种分离纯化。

2.2.2液体培养基配制

操作同2.2.1，制作过程不需要加琼脂，量取100 mL倒入三角瓶，八层纱布封口，绳子扎紧，再用两层报纸扎紧，0.12 MPa、121 ℃高温灭菌20 min，备用。培养基放入培养箱培养3 d，确认没有杂菌污染，进行接种。

2.2.3复合土包埋介质制备

复合土和水的比例是1:1.22，将复合土和水按比例混合拌均匀，静置半小时。然后称取混合料189 g分装入500 mL罐头瓶，将料面压平用无菌透气封口膜封口，耐高温橡皮筋绑好，0.12 MPa、121 ℃高温灭菌60 min，备用。

2.2.4麦麸包埋介质制备

麦麸和水的比例是1:1.5，先将麦麸和水按比例混合拌匀，静置半小时。然后称取混合料150 g分装入500 mL罐头瓶，将料面压平用无菌透气封口膜封口，耐高温橡皮筋绑好，0.12 MPa、121 ℃高温灭菌20 min，备用。

2.2.5琼脂包埋介质制备

量1000 mL加入水锅中，煮沸后加入20 g琼脂，继续加热搅拌至融化，补水定容至1000 mL，趁热量取300 mL倒入罐头瓶，用无菌透气封口膜封口，耐高温橡皮筋绑好，0.12 MPa、121 ℃高温灭菌20 min，备用。

2.2.6主要仪器设备

高压蒸汽灭菌锅、恒温培养箱、双人操作超净工作台、培养室、臭氧机、接种枪、加湿器、枪头盒。

2.2.7其他准备

取边长30 cm方形纱布两层放入罐头瓶中，用无菌透气封口膜封口，耐高温橡皮筋捆绑，0.12 MPa、121 ℃高温灭菌20 min，备用。培养室使用前用臭氧机杀灭空气中的细菌。

2.3试验方法

2.3.1菌种分离

无菌条件下将蛹虫草子实体用无菌水冲洗3次，用无菌纸擦干，手术刀经酒精灯火焰，待用无菌水降温切取子实体顶端1 cm于已灭菌的培养皿中，切成每段约2 mm的小段，用已灼烧降温的接种针挑取一段放入试管斜面固体培养基底部中央（标记为C₂）。放置22 ℃培养箱避光培养，每隔一天观察试管是否污染，若有污染立即清除。待白色菌丝长成直径约1.5 cm，挑取尖端菌丝按照无菌操作进行转管。蛹虫草子实体靠近顶端部位本身具有一定的抑菌能力，因此进行表面消毒时只需用无菌水冲洗3次即可。杨玉红等^[30]对比了菌种分离不同前处理对菌丝生长的影响，结果显示未经酒精处理的菌丝体较经过酒精处理的萌发早、长势旺盛。经孢子分离得到的蛹虫草菌株性状不稳定，不易操作，而且生物转化率较组织分离低，一般采用组织分离的方法获得蛹虫草菌种^[31]。

2.3.2菌种培养

无菌条件下，用接种针挑取C₂试管种3块（约0.25 cm²）接种入装有100 mL液体培养基摇瓶，22 ℃、120 r/min摇床培养4~5 d，备用。

2.3.3接种方式的试验

用流动的水对大麦虫幼虫进行冲洗，晾干表面水分，在无菌条件下将2.3.2中的菌种按照以下方法接种，接种完毕遮光20 ℃培养，观察记录，考察接种方式对侵染率的影响。

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