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摘 要

本文旨在探讨Macranthoin G(MCG)对过氧化氢(H₂O₂)诱导的嗜铬细胞瘤细胞(PC12)细胞毒性的保护作用和澄清潜在的保护机制。方法是采用大鼠嗜铬细胞瘤细胞(PC12)为研究对象，以H₂O₂作为诱导凋亡因素，建立体外模拟自由基损伤诱导细胞凋亡模型，采用MTT比色法分析检测细胞的存活率，用流式细胞术检测PC12细胞凋亡的百分率。结果表明，在进行H₂O₂处理PC12细胞之前，先将其与MCG反应，可有效的增加细胞活力和线粒体膜电位（MMP）；此外，MCG还可增强超氧化物歧化酶(SOD)的抗氧化酶活性、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性，同时降低丙二醛(MDA)含量和细胞内活性氧簇(ROS)，以及细胞凋亡。这些结果表明，MCG应鼓励作为一个潜在的氧化损伤诱导的神经退行性疾病的治疗剂而进行进一步研究。

关键字：Macranthoin G，过氧化氢，PC12细胞，抗氧化

Abstract :

The present study is aimed to investigate the protective role of Macranthoin G(MCG) Against the cytotoxicity induced by hydrogen peroxide (H₂O₂) and to elucidate potential protective mechanisms in pheochromocytoma (PC12) cells. The results showed that treatment of PC12 cells with MCG prior to H₂O₂ exposure effectively increased the cell viability, and stabilized the mitochondria membrane potential (MMP); furthermore, it enhanced the antioxidant enzyme activities of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), and glutathione peroxidase (GSH-Px); it also decreased the malondialdehyde (MDA) content, intracellular reactive oxygen species (ROS), as well as cell apoptosis. These results implied that MCG should be encouraged for further research as a potential therapeutic agent for neurodegenerative diseases induced by oxidative damage.

Keywords: macranthoin G, hydrogen peroxide_, PC12, antioxidant

目录

1 前言 4

1.1 氧化 4

1.2 氧化剂与抗氧化剂 4

1.3 氧化应激 4

1.4 细胞凋亡模型 5

1.5 自由基清除剂 5

1.5.1 抗坏血酸 5

1.5.2 谷胱甘肽 5

1.5.3 褪黑素 5

2 材料和方法 6

2.1 试剂 6

2.2 仪器 6

2.3 细胞和细胞培养 6

2.4 细胞活力测定 6

2.5 丙二醛(MDA)含量的测定，SOD，GSH-Px活性和CAT分析 7

2.6 ROS和MMP测量 7

2.7 细胞凋亡的检测 8

2.8 数据分析 8

3 结果与讨论 8

3.1 MCG对H₂O₂诱导PC12细胞存活率的影响 8

3.2 MCG对H₂O₂诱导PC12细胞MDA含量的影响 9

3.3 MCG对H₂O₂诱导的PC12细胞产生的抗氧化酶的影响 10

3.4 MCG对H₂O₂诱导的ROS的产生和对PC12细胞MMP的影响 11

3.5 MCG对H₂O₂诱导的PC12细胞凋亡的影响 12

结论 13

参考文献 14

致谢 17

1 前言

1.1 氧化

氧化对于大多数生物的生存来说，是个必不可少的步骤，它们通过有氧呼吸这个过程获得所需的能量。机体氧化产生自由基，自由基具有强氧化性，体内活性氧自由基具有一定的功能，如免疫应答和信号传导过程。但过多的活性氧自由基就会有破坏行为，导致人体正常细胞和组织的损坏，进而引起衰老效应及慢性疾病。这个时候我们就需要抗氧化剂(Antioxidants)的存在，它是一类阻止氧气不良影响的，能帮助捕获并中和自由基，从而祛除自由基对人体损害的物质。

1.2 氧化剂与抗氧化剂

氧化剂和抗氧化剂之间的不平衡存在着潜在危险，因为它可以向细胞内积累活性氧簇（ROS），如超氧阴离子自由基(•O₂^-)、羟基自由基(•OH)、单线态氧(¹O₂)、过氧自由基(ROO·)、过氧自由基(HOO·)和过氧化氢(H₂O₂)^[1]。

1.3 氧化应激

氧化应激(Oxidative Stress,OS)是指体内氧化与抗氧化作用失衡，倾向于氧化，产生大量氧化中间产物，如活性氧自由基(ROS)和活性氮自由基(RNS)^[2]。氧化程度超出氧化物的清除，从而导致组织损伤。氧化应激是由自由基在体内产生的一种负面作用，并被认为是导致衰老和疾病的一个重要因素。氧化应激介导的细胞损伤长期以来被认为是老化和在多种神经变性疾病的一个主要的原因，包括阿尔茨海默氏病和帕金森氏病^[3]。

阿尔茨海默病(Alzheimer"s disease,AD)是老年人中最常见的神经退行性疾病之一，是造成痴呆的最常见原因，占痴呆患者总数的2/3以上^[4]。在65岁以上人群中，西方约有5%的人患此病，我国60岁以上人群AD的患病率为3%～5%^[5]。AD病因为其发病因素众多，发病机制又尚不完全清楚。近年研究发现,氧化损伤所造成的神经元凋亡是造成AD的重要原因之一^[6]。

需氧细胞在代谢过程中会产生一系列活性氧簇，即ROS。中、高浓度的ROS通过细胞氧化应激反应可诱导细胞凋亡甚至导致其坏死。具体地说，ROS可攻击膜脂质、酶、和其它必要的细胞成分，以触发一系列反应，如脂质过氧化，或氧化DNA或蛋白质， 从而改变多条信号通路的通过，最终促进细胞死亡、凋亡或坏死^[7]。此外，由于吸入氧利用率高而抗氧化保护系统^[8]的低容量，中枢神经系统特别容易受到氧化应激。

1.4 细胞凋亡模型

过氧化氢(H₂O₂)是活性氧族(reac-tiveoxygenspecies,ROS)的主要成分之一,可以跨膜扩散进入细胞内，是一种比较常用的细胞氧化应激诱导剂，广泛用于诱导细胞凋亡模型。最近的研究表明，H₂O₂诱导的细胞毒性在大鼠嗜铬细胞瘤细胞-PC12上有很好的表现，这对研究神经和神经化学提供了一个有用的模型系统，例如：1、膜和核损害；2、线粒体减少膜电位(MMP)和抗氧化酶活性，如超氧化物歧化酶(SOD)，过氧化氢酶(CAT)，细胞内谷胱甘肽的量(GSH)，和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)；3、积累的caspase-3的活化^[9]。其治疗策略侧重于抗氧化剂所介导的ROS的预防，这对于延缓疾病是一个合理的策略^[10]。

1.5 自由基清除剂

许多合成的抗氧化剂，如：BHA（丁基羟基茴香醚）、BHT（二丁基羟基甲苯）、PG(没食子酸丙酯）、TBHQ(特丁基对苯二酚)等已被证实是强自由基清除剂，但人们怀疑它们具有致癌性，会引起肝损伤^[11]。因此，现在越来越多的人专注于从天然来源中分离和鉴定食源性抗氧化剂用于神经保护电位^[12]。

1.5.1 抗坏血酸

抗坏血酸，或称维生素C，是动植物体内的氧化-还原催化剂，可中和诸如过氧化氢这类的活性氧化物，减轻抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase）基底的氧化应力（oxidative stress），保护身体免于自由基的威胁^[13]。

1.5.2 谷胱甘肽

谷胱甘肽是一种含有半胱氨酸的多肽,存在于多数需氧生物体内，由于半胱氨酸上的巯基具有还原性，能在氧化后再被还原，所以谷胱甘肽有抗氧化功能^[14]。鉴于它在细胞内的高浓度和在细胞氧化还原态中所扮演的中心角色，谷胱甘肽是最重要的细胞抗氧化剂之一。谷胱甘肽还具有广谱解毒作用，不仅可用于药物，更可作为功能性食品的基料，在延缓衰老、增强免疫力、抗肿瘤等功能性食品广泛应用^[15]。

1.5.3 褪黑素

褪黑素是一种强大的抗氧化剂。它可以轻易的穿过细胞膜和血脑屏障，和其他抗氧化剂不同，它不参与到还原循环(Redox Cycling)中^[16]。像维生素C这种参与氧化还原循环中的抗氧化剂可能会起到促氧化剂的作用从而促进自由基的形成。褪黑素一旦被氧化就不能还原回去，因为氧化后的褪黑素会与自由基形成几种稳定的最终产物。因此褪黑素被称作终端抗氧化剂^[17]。

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