从核桃青皮中靶向分离酪氨酸酶抑制剂

论文总字数：18631字

摘 要

本实验通过对70%丙酮核桃青皮提取物进行分馏、提纯，最终得到五种低分子量没食子酰基单宁酸。通过对其化学性质和光谱（NMR、MS）进行分析，我们发现这五种化合物分别为1，2，6-三没食子酰基-b-D-葡萄糖（1），3，4，6-三没食子酰基-b-D-葡萄糖（2），2，3，4，6-四没食子酰基-b-D-葡萄糖（3），1，2，3，4，6-五没食子酰基-b-D-葡萄糖（4），单宁酸（5）。对蘑菇酪氨酸激酶活性有很强的抑制力，IC₅₀值为35.27-74.76mM。相对地，阳性对照组曲酸IC₅₀值为342.14mM。进一步研究表明，当以为研究对象时，可以抑制黑色素生成，同时降低胞内酪氨酸激酶基因的转录和翻译水平。因此，化合物1-5在化妆品的皮肤美白行业中将有着广阔的前景。

关键词：

漾濞泡核桃；提取物；没食子酰基单宁酸；酪氨酸激酶；B16F10小鼠黑色素瘤细胞

ABSTRACT：The phytochemical investigation,including fraction and purification of 70% acetone extracts of seed husks, an agricultural residue, led to the isolation of five low-molecular weight galloyltannins. The strctures of the extractives were elucided as 1,2,6-tri-O-galloyl-b- -glucose(1), 3,4,6-tri-O-galloyl-b-glucose(2), 2,3,4,6-tetra-O-galloyl-b-glucose(3), 1,2,3,4,6-

penta-O-galloyl-b-glucose(4), tannic acid(5), primarily based on their spectral (NMR、MS) and chemical evidence. Galloyltannins 1-5 showed strong inhibitory activity against mushroom tyrosinase, with s ranging from 35.27 to 74.76mM; kojic acid, which was used as a positive control, had an IC50 value of 342.14mM. It was further found that 1-5 inhibited melanin produ- ction and exhibited intracellular tyrosinase activity , as well as down-regulated mRNA and prot- ein expression levels of tyrosinase, in B16F10 mouse melanoma cells. Therefore, the isolated from seed husks of J. Sigillata may serve as potential candidates for hyperpigmentation reme- diation and as skin-writening agents in the cosmetics industry.

Keywords:

Juglans sigillata; Extractives; Galloyltannin; Tyrosinase; B16F10 mouse melanoma cells

1 前言

酪氨酸激酶是一组催化蛋白质酪氨酸残基磷酸化的酶， 能催化ATP上的磷酸基团转移到许多重要的酪氨酸残基上，使其残基磷酸化^[2]，激活细胞内下游信号转导途径， 调节细胞的增殖、分化、迁移等生物效应。蛋白酪氨酸激酶按其结构可分为受体酪氨酸激酶( RPTK)和非受体酪氨酸激酶(NRPTK)^[3]。受体酪氨酸激酶通常只具有一个可以与特定配体相结合的细胞外结构域、一个跨膜区及一个可以选择性地与底物结合并将其磷酸化的细胞内激酶域。将配体与受体酪氨酸激酶的细胞外结构区域结合， 引起其结构改变从而产生酶催化活性。许多受体酪氨酸激酶都与肿瘤的形成相关， 其原因可能包括基因突变、重排或激酶的过度表达。目前已知的约60个受体酪氨酸激酶根据其细胞外区域结构的不同可被分为20多个亚家族，如图1所示^[3]。

图1.受体酪氨酸激酶家族

在有酪氨酸激酶基因突变的临床肿瘤病例中，表皮生长因子受体( EGFR )家族（包括 EGFR (HER 1/ERBB1) 、HER2 ( neu /ERBB2)、HER3 ( ERBB3)和 HER4 (ERBB4)，）的突变占据着极高的比例，往往高表达于上皮细胞肿瘤，也因此，EGFR正逐渐成为抗癌药物的新靶点^[4]。其他的受体酪氨酸激酶还包括常在血液系统肿瘤中高表达胰岛素受体（INSR）家族（包括胰岛素受体、胰岛素样生长因子受体和胰岛素相关受体等）、在上皮细胞肿瘤和肺癌中常见的血小板衍化生长因子受体( PDGFR)家族（还包括集落刺激因子1受体(CSF1R)、干细胞生长因子受体( K IT /SCFR )和 FLK2/FLT3）、促进血管生成的成纤维细胞生长因子受体(FGFR)家族（包括 FGFR1， FGFR2，FGFR3和FGFR4）、神经上皮细胞和成神经细胞瘤中常见的原肌球蛋白受体激酶(TRK)家族（包括TRKA，TRKB和TRKC）、在肿瘤侵袭、转移及血管生成中发挥着重要作用的肝细胞生长因子受体(HGFR)家族（包括MET 和 RON，HGF）、充当血管新生调节因子的血管生成素受体(TIE)家族（TIE1和TIE2( TEK)）、白细胞酪氨酸激酶(LTK)家族（包括LTK和ALK）等等。相对地，非受体酪氨酸激酶不是跨膜受体， 一般没有细胞外结构， 它们通常持续或暂时位于胞浆， 或在细胞膜内侧与跨膜受体结合， 所以又称为胞浆型酪氨酸激酶。非受体酪氨酸激酶主要是通过细胞因子受体、T细胞受体及其他信号通路执行信号转导功能。非受体酪氨酸激酶主要包括 SRC， ABL， JAK， ACK， CSK，FAK， FES， FRK， TEC和 SYK等家族，如图2所示^[3]。

图2.非受体酪氨酸激酶家族

Lck（lymphocyte-specific protein tyrosine kinase，淋巴细胞特化蛋白酪氨酸激酶）是Src家族的成员之一，负责细胞早期上游信号的转导。Lck由免疫系统的成熟淋巴细胞产生，通过其对酪氨酸残基的磷酸化而激活淋巴细胞的胞内信号通路，保证T细胞的正常发育与发挥作用^[7]。然而，这些细胞活动可能导致一些细胞活素（例如白介素-2和IFNc）的产生，而进一步导致细胞炎症反应、抗肿瘤在内的某些免疫调节作用。因此，某些针对Lck的抑制剂可能有成为治愈类风湿性关节炎，特异性皮炎，哮喘，器官移植的免疫调节药物的潜力^[8]。其次，酪氨酸激酶在黑色素的形成中也起着关键的作用。该酶利用自身的催化中心来催化羟基化作用，使左旋酪氨酸转变为二羟苯丙氨酸（多巴），并进一步转化为多巴醌直至黑色素，如图3所示^[9]。

图3.黑色素生成过程

黑色素的沉积是肤色（包括瞳孔）和发色形成过程中必不可少的环节之一。黑色素广泛存在于细菌，植物及动物体内，是一类结构复杂的类酪氨酸酶多聚物^[11]，有着多重的生理作用，包括保护皮肤免受紫外线的辐射和消除氧自由基的伤害^[12]。然而，过量的黑色素表达会导致黑色素沉积的失控，引起日光性着色斑甚至是黑色素瘤在内的疾病^[13]。当受到紫外线照射或其他环境压力时，细胞会产生促黑激素（a-MSH）以应对这些环境压力^[16]。同时，酪氨酸激酶，激酶相关蛋白（TRP-1，2）也参与黑色素的生成^[17]。而酪氨酸激酶和TRP-1基因的表达由小眼畸形相关转录因子（MITF），后者的激活则依靠环腺甘酸（cAMP）。MITF通过抑制胞外信号调节激酶（ERK）和AKT/蛋白激酶B信号作用通道在黑色素沉积中扮演着重要角色^[18]。皮肤美白类化妆品起效的关键往往在于通过抑制黑色素细胞和角蛋白细胞中黑色素的形成、毛发黑素小体转录水平^[20]。有研究表明，超过50％的原癌基因和癌基因产物都与蛋白酪氨酸激酶突变有关^[25]。由此引发的癌症包括慢性粒细胞白血病 (chronicmyeloidleukemia，CML)、非小细胞肺癌 (nonsmallcelllungcancer，NSCLC)等等。

因此，以酪氨酸激酶信号通路为靶点的抗癌药物设计一直是近年来研发抗癌药物的热点之一。在治疗CML时，伊马替尼往往作为一线药物。伊马替尼在体内外均可强烈抑制 ABL酪氨酸激酶的活性，特异性地抑制 BCR-ABL的酪氨酸激酶活性及Ph 细胞的增殖^[26]。吉非替尼是一种高选择性 EGFR酪氨酸激酶抑制剂，主要用于治疗NSCLC，尤其是转移复发性NSCLC^[28]。对于肾细胞癌和肝细胞癌的治疗则主要应用索拉非尼。索拉非尼主要通过抑制VEGFR-2、VEGFR-3和PDGFR-b来阻止肾细胞癌新生血管的形成^[29]；对于肝细胞癌，索拉非尼通过抑制Ras/Raf/细胞外信号调节激酶/细胞外信号调节蛋白激酶信号通路来抑制肿瘤细胞增殖，同时通过抑制酪氨酸激酶受体来阻止新生血管的形成^[30]。

然而，在某些情况下，部分患者对一些抗癌药物表现出程度不同的耐药性。以NSCLC为例，耐药包括原发耐药和获得耐药。原发耐药是指患者自身EGFR基因的突变导致患者对EGFR-TKI的不敏感。例如在EGFRv3表达的细胞系中，吉非替尼不能抑制蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)或AKT的磷酸化，无法阻断EGFR下游信号通路的持续激活^[31]。而获得突变指的是在使用药物一段时间后发生的基因突变。Gadgee^[33]等发现1例治疗前存在EGFR19号外显子缺失突变的NSCLC患者在服用吉非替尼后疾病缓解 ，但28个月后疾病再次出现进展。进一步研究发现，该患者在原有的基因突变基础上又发生了错义突变，位于20号外显子790位上密码子(T790M)，从而使EGFR重新处于激活状态。由此推测T790M突变可能是导致EGFR—TKI获得性耐药的一种机制。目前解决耐药问题的方法主要由以下几种:一是联合用药。付晓霏的实验发现，单独应用选择性COX．2抑制剂塞来昔布、EGFR阻断剂埃罗替尼对体外培养结肠癌细胞株HT-29有抑制增殖作用，联合使用有协同抑制作用^[34]。二是基团替代。李顺来^[35]等通过对伊马替尼，尼罗替尼的活性结构及药效团进行分析研究，探讨了酪氨酸激酶与抑制剂的相互作用模式并发现第2代抑制剂尼罗替尼改变尾部结构，引入三氟甲基，甲基咪唑环， 会使得整个尼罗替尼分子与酶结合作用中氢键作用和疏水相互作用大大增强。这可能就是尼罗替尼与酶的结合更加牢固，不易出现耐药性的原因之一。三是“单药物多靶点”的设计思路。多靶点酪氨酸激酶抑制剂的优势主要体现在以下几点:（1）、癌症的发展往往涉及到多个细胞信号通路，当某个通路受到抑制时，信号还可以通过替补途径导致细胞进一步的增殖。而多靶点的药物则能在更大程度上尽可能遏制信号的传递，甚至在一种靶点疗效降低后仍有其他靶点起作用（容错率高），即有着更佳的治疗效果；（2）、由于多种药物不可避免地带来程度不同的细胞毒性，因此寻找多靶点的单一药物能有效减少人体正常细胞的损伤；（3）、能有效防止因药物联用而造成的药物吸收，代谢的相互影响。例如拉帕替尼在EGFR和HER2过表达的肿瘤细胞系中可抑制MAPK 和 PI3K 的信号转导。前者已经于2007年经 FDA 批准上市，用于治疗头颈部癌、乳腺癌、非小细胞肺癌和胃癌等等^[37]。

相比化学合成的药物，同样能够抑制酪氨酸激酶的天然产物有着副作用少，原料易获得，生产难度小，成本低的优势。一些抑制黑色素生成的天然化合物，例如对二苯酚，杜鹃花酸，曲酸，鞣花酸等等，在化妆品和药品行业中大受欢迎^[18]。Hsiu-Mei Chiang^[39]的实验表明从景天科提取的水醇提取物能够通过调节CREB/MITF/酪氨酸激酶信号通路来抑制 B16F0细胞黑色素的合成。Yong-Hua Hu^[40]等的实验表明，（蜂胶中的）间氯桂皮酸可以有效抑制蘑菇酪氨酸激酶的活性。

单宁酸是一类含有多酚结构的水溶性低聚物，能够结合或沉淀水溶性蛋白。单宁酸在维管植物中很常见，尤其是在维管植物的木质组织中，不过在叶，花，种子中也可以找到。富含单宁酸的植物由于其特殊的气味，捕食者往往对其敬而远之。单宁酸包括两类，缩合类单宁和可水解单宁。缩合类单宁由黄酮醇缩合而成的聚合网状结构以生物合成的方式形成，例如原花青素（proanthocyanidin）(见图4)。

图4.从高粱和桉树中分离的原花青素

可水解单宁是含有一个或多个没食子酰基的糖（尤其是葡萄糖）酯。这类物质会使不溶性的清蛋白，淀粉，凝胶发生沉淀。这种与蛋白的反应在实际生产中常常用于以动物皮毛制备皮革，例如从漆树和桉树叶中分离的鞣云实素，从天竺葵和叶下珠属分离的老鹳草鞣质（见图5），这两种物质都具有抑制逆转录的作用而显示出抗HIV的活性^[41]。

图5.鞣实云素和老鹳草鞣质

C.G. Mohan等^[42]研究表明,1,2,3,4,6-五没食子酰基葡萄糖（PGG）可以通过抑制肝脏及脂肪组织中11b-羟基类固醇脱氢酶（11-HSD）的活性来减少高脂肪饮食（HFD）带来的脂肪堆积效果。其次，Takuo Okuda^[44]在综述性论文中总结道，单宁酸还具有抑制脂质过氧化、致癌物诱变的作用，以及抗炎（细菌性炎症）作用。最值得一提的是，单宁酸在动物实验中已经表现出了抗癌的功效，并且对正常细胞无细胞毒性的损伤。从现有的研究成果看，单宁酸主要通过（1）抑制EGF来调节转录，以避免早期癌症的诱发或者抑制某些消化道癌细胞的转移、侵袭^[47]；（2）高剂量PGG通过抑制脂肪酸合成来达到抗癌效果^[48]；（3）降低金属基质蛋白酶（MMPs）（几乎能降解细胞外基质(ECM)中的各种蛋白成分,破坏肿瘤细胞侵袭的组织学屏障，在肿瘤侵袭转移中起关键性作用）活性以抑制某些特定部位癌细胞的转移、侵袭并导致其死亡^[50]。

胡桃科的漾濞泡核桃是一种生长快的落叶乔木，产于中国西南的贵州，云南，台北，四川等当地山区。核桃青皮作为一种农业和食品生产的废渣，由于其特殊的药用价值，在药品和化妆品行业中发展的潜力很大。就目前研究成果而言，核桃属植物中抗肿瘤的活性成分主要包括胡桃醌和多酚两大类。相关研究表明，胡桃醌对小鼠自发性乳腺癌和移植性乳腺癌有明显的抗癌活性，使艾氏腹水癌细胞的有丝分裂异常^[53]。然而，醌类化合物在抗癌同时也表现出了细胞毒性的副作用。醌类的细胞毒活性作用的靶点主要是DNA，这些醌类主要作为DNA插入剂，烷化剂，拓扑异构酶抑制剂来发挥作用。B．Kiran Aithal等研究了胡桃醌对B16F1黑色素瘤细胞的细胞毒性，结果证实了胡桃醌可以引起细胞的凋亡及坏死^[55]。除此之外，核桃属植物还有其他关键的药用价值。由于核桃相比其他坚果类含有更多的w-3，6多不饱和脂肪酸，维生素E和富含精氨酸的蛋白质^[57]，因此每日食用核桃可能会减少患心血管疾病（CVD）的风险^[58]。司传领等用70%丙酮从核桃楸树皮中提取出了短叶松素，花旗松素，蛇葡萄素，山奈酚，槲皮素，杨梅素，实验表明这六种化合物皆具有较强的抗氧化活性^[59]。胡桃茎皮的醚提取物有一定的抗炎作用，具体表现在对革兰氏阳性菌（尤其是金黄色葡萄菌和变异链球菌）以及对革兰氏阴性菌（尤其是大肠杆菌和铜绿假单胞菌）及致病性酵母（白色假丝酵母）有抑制作用^[60]。Shibu M.对动物和人类的研究表明，核桃中的多不饱和脂肪酸通过与氧化应激和炎症反应相关过程来改善记忆，认知以及神经元构建。他的最新研究还发现，核桃中存在着能够激活溶酶体的活性物质^[61]。

然而对有效抑制酪氨酸激酶的天然产物的研究尚处于起步阶段，很多活性物质的研究仍处在动物实验甚至是产物提纯阶段。目前虽有核桃提取物的文献报道，但其中的大多数研究方向在于提取方法而非作用本身，而对于从核桃中提取的抗酪氨酸激酶活性物质的研究，据我们所知更是相对匮乏。为了弥补这一空白，也为了验证核桃的传统用途和阐明其药用价值，我们用70%的丙酮去溶解核桃青皮里的活性成分去探索其抗酪氨酸激酶效果的机理，通过溶剂萃取和柱色谱的反复分离，最终得到溶于正丁醇的五种低分子量的没食子酰基单宁酸。本篇文章将详细描述核桃萃取物的分离过程及其对酪氨酸激酶的抑制力，同时也对药物作用下的细胞活性进行了研究，以期对于未来的皮肤美白，抗癌药物的研发等科研方向起到抛砖引玉的作用。

2 实验及方法

2.1 植物取材

泡核桃青皮取自于云南省三台市。

2.2 萃取和分馏

在室温下用70%丙酮去提取干燥的漾濞泡核桃青皮（3.08 kg）反复三次去提取足够量的产物。如图6所示，提取物在真空的旋转蒸发器中混合，渗透，浓缩以后，得到的残留物经过一系列极性液体的梯度分馏之后，最终得到正己烷（4.81 g，产率0.16%）-二氯甲烷（3.31 g，产率0.11%）-乙酸乙酯（36.15 g，产率1.17%）-正丁醇（42.82 g，1.39%）-水（149.30 g，产率4.85%）溶性粉末。后者被装在密封的小玻璃瓶中，保存在-4°C，黑暗中用以进一步实验。

图6. 70%的丙酮提取物的萃取与分馏

2.3 低分子量没食子酰基单宁酸的分离

如图6所示，一部分正丁醇溶性分馏物（32.81 g）通过葡聚糖凝胶柱色谱用甲醇-水（3:1，v/v）洗脱得到五种粗分馏物:B₁（3.29 g，）B₂（10.11 g），B₃（4.12 g），B₄（13.88 g），B₅（1.20 g），并通过薄层层析来分析测定。接下来将分馏物B2通过硅胶柱，并以梯度的二氯甲烷-丙酮体系（8:1-7:3，v/v）作为流动相，结果得到三种后续产物，分别是B₂₁，B₂₂，B₂₃。其中B₂₂再次通过葡聚糖凝胶色谱柱，逐步以甲醇-水体系（1:2和1:4，v/v）的流动相洗脱得到81mg的黄色非结晶化合物1。分馏物B₄通过硅胶色谱柱，以二氯甲烷-甲醇-水体系（7:2:1，v/v）

作为流动相洗脱来进一步提纯并得到化合物5（79 mg），B₄₂（10.25 g），B₄₃（1.62 g）。接下来将B₄₂通过葡聚糖凝胶色谱柱，并以甲醇-水体系（1:2，v/v）和无水乙醇-正己烷体系（1:2和1:3，v/v）作为流动相洗脱，得到黄色非结晶化合物2（52 mg）。分馏物B₃反复通过葡聚糖凝胶色谱柱，以甲醇-水体系（1:2和1:4，v/v），无水乙醇-正己烷体系（1:1和1:3，v/v）作为流动相洗脱，最终得到同样是黄色非结晶的化合物3（48 mg）和化合物4（63 mg）。

2.4 蘑菇酪氨酸激酶活性分析

我们参照相关文献，用光谱光度测量法在490 nm处测定分析提取物对于蘑菇酪氨酸激酶活性的影响^[62]。简单来说，就是在96孔板中加入80 ml的磷酸盐缓冲液（PH=6.8），40ml的蘑菇酪氨酸酶（500 U/ml）以及40ml的待测化合物，25°C共同培养5 min。紧接着添加底物（25 mM L-DOPA，40 ml）。25°C培养10min后，用490 nm波长的酶标仪检测多巴色素的产生。曲酸被作为阳性对照。数据用如下公式的一个抑制率的百分比来表达 :

抑制率（%）=[(A_待测样品-A_空白对照)/A_控制×100 ]%

其中A_待测样品包含待测样品和酶，A_空白对照只包含待测样品而不包含酶，A_控制只包含酶而不包含待测样品。

2.5 细胞系与细胞培养

B16F10小鼠黑色素瘤细胞取自于美国模式菌种收集中心(ATCC)，并用含有10%PBS，100 U/ml青霉素以及100 mg/ml链霉素的细胞培养基（DMEM）在37 °C，95%湿度，5%CO₂环境下培养。

2.6 胞内酪氨酸激酶活性的测定

该实验测量B16F10小鼠黑色素瘤细胞对于左旋多巴的氧化速率来衡量该细胞的酪氨酸激酶活性。将B16F10小鼠黑色素瘤细胞（4×10⁵个）接种于6孔板中。在培养32 h后，将细胞和50 uM提取物混合24 h。之后取出（细胞）用冷PBS洗脱两次。最终，用包含1%（w/v）三硝基甲苯和1 mM 苯甲基磺酰氟（PMSF）的0.2 ml PBS buffer（PH=6.8）溶解细胞颗粒。在96孔板中加入100ml细胞提取物和100 ml的左旋多巴（2mM）以便进行接下来的酶活分析。反应产物多巴色素在37°C，60 min后的形成依靠酶标仪490 nm波长检测。结果用空白组的百分比表示。

2.7 统计学分析

所有的实验均被重复三次，数据以标准差的形式表示，并用方差分析中的邓肯法来判断各组别数据差异的显著性，P值在“plt;0.05”时表明差异显著。分析软件为Windows 7平台下的SPSS 19.0。

3 结果与讨论

3.1 低分子量没食子酰基单宁酸的化学结构

图7.从核桃青皮中分离的低分子量没食子酰基单宁酸化学结构的阐明:1，2，6-三没食子酰基-b-D-葡萄糖（1），3，4，6-三没食子酰基-b-D-葡萄糖（2），2，3，4，6-四没食子酰基-b-D-葡萄糖（3），1，2，3，4，6-五没食子酰基-b-D-葡萄糖（4），单宁酸（5）。

从核桃青皮中分离的低分子量提取物，根据其化学发光特性，化学结构如图7所示，1，2，6-三没食子酰基-b-D-葡萄糖（1）^[63]，3，4，6-三没食子酰基-b-D-葡萄糖（2）^[64]，2，3，4，6-四没食子酰基-b-D-葡萄糖（3）^[64]，1，2，3，4，6-五没食子酰基-b-D-葡萄糖（4）^[65]，单宁酸（5）^[66]。此外，这五种提取物均为没食子酰基单宁酸类化合物。值得一提的是，化合物2，3，5还存在端基异构效应。

3.2 提取物对于蘑菇酪氨酸激酶活性的抑制力

提取物对于蘑菇酪氨酸激酶活性的抑制力实验以曲酸作为对照，用L-DOPA作为酪氨酸激酶底物。每种化合物设置多种浓度，相关抑制率用IC₅₀值表示。结果如表1所示，化合物1-5的IC₅₀值分别为74.76，76.37，57.89，47.63，35.27 mM，相对地，曲酸组IC₅₀值为342.14 mM。由此可见，提取物对于蘑菇酪氨酸激酶的活性有很强的抑制力。就目前而言，化合物1-4对于蘑菇酪氨酸激酶活性的显著抑制效果的研究尚属首次。

表1.核桃青皮中分离的低分子量提取物对于蘑菇酪氨酸激酶活性的抑制力

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