大肠杆菌BL21菌株一步法感受态细胞制作

论文总字数：5721字

摘 要

利用一步法制备大肠杆菌BL21菌株感受态，选用pUC19质粒进行转化实验，分别讨论转化过程中不同的冰水混合物中放置的时间，室温中放置的时间，复苏时间以及摇床转速对感受态转化率的影响，结果表明，在冰水混合物中放置30min，然后室温放置10分钟，在150转37度摇床上复苏60min。最后培养的菌落数最多。

关键词：大肠杆菌BL21，感受态，质粒提取，转化

Abstract：The competent cells of E.coliBL21 strain were prepared by TSB, choose pUC19 plasmid transformation experiments, and the variation of transformation rate for different time is placed in ice water and at room temperature, the recovery time and the speed of Shaking table. Experimental results showed that 30 min is placed in ice water, and then placed at room temperature for 10 min. in 150 turn, 37 degrees shaking bed recovery 60 min. Finally, cultivate the colony count most.

keywords: E.coli BL21, competence, plasmid extraction, transformation

目 录

前言 1

1 材料与方法 1

1.1 供试菌株和质粒 1

1.2 主要试剂与培养基配方 1

1.3 方法与步骤 1

1.4 转化过程中不同冰浴时间对转化效率的影响 1

1.5 转化过程中不同室温放置时间对转化效率的影响 1

1.6 转化过程中不同复苏时间对转化效率的影响 1

1.7 复苏时摇床不同的转速对转化效率的影响 1

2 结果与分析 1

2.1 不同冰浴时间对转化效率的影响 1

2.2 不同室温放置时间对转化效率的影响 1

2.3 不同复苏时间对转化效率的影响 1

2.4 不同转速对转化效率的影响 1

结 论 1

参考文献 1

致 谢 1

前言

感受态细胞是指细菌细胞在一定的生长阶段，自身或通过人为处理而具有摄取外源DNA并使其基因型和表型发生相应变化的能力，分为自然感受态和人工感受态。转化是指同源或异源的“裸露”DNA分子被感受态细胞摄取并得到表达的水平基因转移过程。基因转化大肠杆菌是基因研究中最常用的技术。如载体构建,DNA片段测序，都需要大量制备和使用大肠杆菌感受态细胞^[1]。制备大肠杆菌感受态最常用的方法是CaCl₂法^[2]。在CaCl₂处理和制备大肠杆菌感受态细胞的过程中，Ca² 是感受态建立和转化的必要条件^[3]。Ca² 的作用就是与细菌细胞膜上的多聚无机磷酸和多聚羟基丁酸化合物形成复合物。并破坏细菌细胞膜上的脂质阵列。从而方便外源DNA的摄入^[4-5]。CaCl₂转化法虽然重复性好、效率高，但操作起来较为繁琐，需要多次离心洗涤细胞、CaCl₂长时间处理受体细胞，并且在转化过程中需要1-2d时间^[6]。

与CaCl₂法相比较，一步制备法的优点是，操作方便，只加一种试剂即可，且不需要另加保护剂就可直接冻存，更快捷稳定，转化时，该法也更方便，此法转化时不需要热激。但一步法对实验操作要求所用器具一定要清洁，制备感受态细胞时所有操作尽量保证在冰上操作，该方法的转化效率也相对较低，适用于对转化率要求不高的实验。

大肠杆菌由于遗传背景清楚，容易培养，克隆载体与表达载体种类繁多，使之成为人们克隆表达外源基因的主要菌株。大肠杆菌表达系统是目前最常用的外源蛋白表达系统^[7]，大肠杆菌BL21 (DE3)菌株是目前最常用的外源基因异源重组表达宿主菌株，其表达载体的构建往往先在DH5a菌株中进行，表达载体构建成功以后再提取质粒转化BL21菌株，并进一步诱导外源基因表达。由于该过程中直接提取构建好的重组质粒转化BL21感受态细胞，因而对感受态细胞的转化效率要求不高，可以采用简单方便的一步法完成。前期研究表明大肠杆菌BL21菌株可以通过一步法实现转化，获得相应的转化子。

大肠杆菌感受态细胞的转化效率会受到诸多条件的影响，比如感受态细胞的保存条件，转化过程中的热击，复苏等，目前已有一些研究报道了这些因素对大肠杆菌感受态转化效率的影响^[8-11]。目前，一步法制备的大肠杆菌BL21菌株的感受态细胞及其转化过程中的操作细节对转化效率的影响还不清楚。本论文基于此，对大肠杆菌BL21菌株一步法感受态细胞的转化条件展开了初步研究。

1 材料与方法

1.1 供试菌株和质粒

大肠杆菌BL21（DE3）菌株，用于制备感受态细胞；

pUC19，保存于大肠杆菌DH5a菌株中，氨苄（AMP）抗性；

1.2 主要试剂与培养基配方

LB培养基：蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl10.0g，去离子水1000ml（固体加1.5%的琼脂）。

含Amp的LB固体培养基：将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右，加入Amp储存液，使终浓度为50μg/mL，摇匀后铺板。

TSB：LB pH6.1，10%PEG3350，5%DMSO，10%甘油，10mM MgCl₂，10mM MgSO₄，高压灭菌。

5*KCM：0.5M KCl，0.15M CaCl₂，0.25M MgCl₂。配几毫升，过滤除菌，负20℃保存，可反复冻融。

溶液Ⅰ：葡萄糖50mmol/L，Tris-Cl 25mmol/L(Ph8.0)，EDTA10mmol/L(pH8.0)。

溶液Ⅱ：NaOH 0.2mol/L，1%SDS(需现用现配)。

溶液Ⅲ：5mol/L KAc 60mL，冰乙酸11.5Ml，H₂O 28.5mL。

TE缓冲液：Tris-Cl 10mmol/L(pH8.0)，EDTA 1mmol/L(Ph8.0)。

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