一株高效降解羽毛菌的鉴定

论文总字数：12171字

摘 要

本实验从淮阴师范学院土壤中分离出能降解羽毛的菌株并对其进行鉴定、保存，实验中涉及菌株的分离纯化、菌株的形态学鉴定以及生理生化鉴定，并通过明胶试验、吲哚试验、耐盐试验、VP试验、糖发酵试验等生理生化实验对所筛选的菌种进行鉴定，根据伯杰式细菌学手册鉴定其种属。

关键词：降解，羽毛，菌株，生化鉴定

Abstract: This experiment was to isolate feather degrading strains from Huaiyin Normal University soil and to study its identification, preservation, purification, morphological, physiological and biochemical identification of strains and to identify the strains by gelatin test, indole test, salt test, VP test, sugar fermentation tests and other physiological and biochemical experiments. Then we identified the bacteria which were screened about its species according to Bergey"s Manual of Bacteriology style.

Key words: degradation, feather, bacterial strain, biochemical identification

目 录

1 前言 3

2 实验材料与步骤 3

2.1 实验材料 3

2.1.1 土壤 4

2.1.2 羽毛 4

2.1.3 试剂 4

2.1.4 仪器 5

2.1.5 培养基 6

2.2 实验步骤 6

2.2.1 土壤悬液样品的制备 7

2.2.2 分离纯化 7

2.2.2.1 菌株的分离 7

2.2.2.2 可降解羽毛菌株的筛选 7

2.2.3 菌株保存 7

2.2.4 初步鉴定 7

2.2.4.1 形态学鉴定 7

2.2.4.2 生理生化鉴定 7

2.2.5 菌种鉴定 9

3 结果与讨论 10

3.1 分离纯化 10

3.1.1 菌株的初筛 10

3.2 初步鉴定 11

3.2.1 形态学鉴定 11

3.2.2 生理生化鉴定 11

结 论 14

参 考 文 献 15

致 谢 16

1 前言

羽毛是家禽经处理后产生的废弃物，产量非常巨大，全球每年可多达几百万吨。传统的处理方法主要为填埋、焚烧，这不仅会对环境造成严重的污染，而且也浪费了宝贵的资源^[1]。羽毛的主要成分是角蛋白，其含量可高达90%，其中富含动物成长所必须的氨基酸、常量元素、微量元素和一些未知生长因子^[2]，在动物饲料、复合材料、食品包装和医药制品等领域展现出良好应用前景^[3]。我国的角蛋白资源非常丰富，但是大部分没有被充分利用，有的还造成了环境污染，近年来由于畜牧业及氨基酸工业的大力发展，这使得蛋白资源非常紧缺，因此，当前应大力研究有效的处理方法，使废弃的羽毛角蛋白能直接转变成蛋白质或者复合氨基酸，使其能直接得到应用或者作为一种提纯氨基酸的廉价易得的原料，从而使其变废为宝，即保护了环境又使资源得到了充分的利用，这将具有显著的经济效益和深远的社会效益^[4-6]。另外，羽毛角蛋白是一种硬性蛋白，其具有不溶于水和抗分解的性质，在一在般条件下是不溶解的，而且不能被一般的蛋白酶水解，因此也给角蛋白的处理提出了很大的难题。用物理化学的方法处理，可能会造成其品质低、氨基酸的破坏严重、耗能多、污染严重等很多问题，而利用生物降解角蛋白却是一种很好的方法，不仅能够改善羽毛角蛋白的营养价值，同时还利用了环境废弃物^[7]。

角蛋白及角蛋白酶在肥料、医药、化妆品等很多领域都有非常高的利用价值和广阔的发展前景。土壤中含有多种能使其降解的菌株，例如从长期堆积羽毛废弃物的土壤及羽毛处理场的污泥中分离到能降解羽毛角蛋白质的嗜麦芽窄食单胞菌属(Stenotrophomonas)、微杆菌属(Microbacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、金黄杆菌属(Chryseobacterium)4种微生物^[10]。从禽肉加工厂的污泥中分离到174株能在牛奶琼脂平板产透明圈微生物菌株，其中42株具有分解羽毛的能力，从中筛选出13株具有较强羽毛降解能力的菌株，均能在48 h内将羽毛完全分解^[10-12]。采用以羽毛粉为唯一碳源和氮源的培养基，从自然界中分离到一株能够高效降解羽毛角蛋白的细菌，经过形态学观察，生理生化实验和16SrRNA基因鉴定，初步确定该菌株为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)^[13]。本文主要研究了土壤中可降解羽毛菌株的筛选，并对这种菌株进行了初步的鉴定和分析，为菌株的实际生产应用奠定了初步的研究基础。

2 实验材料与步骤

2.1 实验材料

2.1.1 土壤

从实验室附近随机取样得到新鲜土壤样品500g左右，使用无菌的塑料袋封袋，保存于4℃冰箱。

2.1.2 羽毛

从市场收集羽毛废弃物，洗净，再用蒸馏水洗多次，烘干备用。

2.1.3 试剂

名称	生产厂家
牛肉膏	国药集团化学试剂有限公司
蛋白胨	国药集团化学试剂有限公司
琼脂粉	SCRC国药集团化学试剂有限公司
K2HPO4•3H2O	南京化学试剂厂
氯化镁	国药集团化学试剂有限公司
硫酸铵	宜兴市试剂二厂
硫酸镁	国药集团化学试剂有限公司
酵母提取膏	国药集团化学试剂有限公司
无水碳酸钠	宜兴市亚盛化工厂
氢氧化钠	中国蚌埠化学试剂厂（安徽）
硫酸铜	宜兴市第二化学试剂
NaCl	国药集团化学试剂有限公司
浓HCl	南京化学试剂有限公司
CuSO4	宜兴市第二化学试剂厂
KCl	丹徒第一化工厂
NH4NO3	徐州市试剂二厂
KNO3	广东汕头市西陇化工厂
浓H2SO4	南京化学试剂有限公司
NaNO2	连云港市化学试剂厂
H2O2	上海桃浦化工厂
结晶紫	中国医药（集团）上海化学试剂公司
乙醇	国药集团化学试剂有限公司
草酸铵	上海化学试剂总厂所属上海试剂一厂
碘	上海化学试剂总厂所属上海试剂二厂
名称	生产厂家
碘化钾	中国医药（集团）上海化学试剂公司
香柏油	上海标本模型厂
葡萄糖	国药集团化学试剂有限公司
乳糖	上海化学试剂总厂所属上海试剂二厂
蔗糖	SCRC国药集团化学试剂有限公司
溴百里酚蓝	上海试剂三厂
氨水	上海久亿化学试剂有限公司
甲基红	崇明县裕安裕西试剂厂
对二甲基苯甲醛	上海试剂三厂
乙醚	上海实验试剂有限公司
溴麝香草酚蓝	上海试剂三厂
对氨基苯磺酸	上海试剂三厂
碳酸钙	上海泗联化工有限公司
MgSO4•7H2O	江苏省连云港市化学试剂厂
明胶	中国医药上海化学试剂公司
可溶性淀粉	中国医药上海化学试剂公司

2.1.4 仪器

名称	型号	生产厂家
电子天平	TE612-L	北京赛多利斯仪器系统有限公司
组合式全温摇床	HD-930	太仓市博莱特实验仪器厂
隔水式恒温培养箱	GNP-9080	上海精宏实验设备有限公司
电热恒温鼓风干燥箱	DHG-9140A	上海精密实验设备有限公司
pH计	PHS-3C	上海三信仪表厂
高压灭菌锅	XQ-LS-30SI	上海博迅实业有限公司
微型旋涡混合仪	WH-3	上海沪西分析仪器厂
恒温水浴锅	HH-S	金坛市忆通电子有限公司
恒温磁力搅拌器	85-2	常州国华电器有限公司

2.1.5 培养基

基础培养基（LB）：蛋白胨10g，酵母浸膏5g， NaCl10g，自来水1000mL，pH为7.0-7.5，121℃灭菌20min。

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