论文总字数：10744字

摘 要

目的：十大功劳叶化学成分复杂，通过有效的手段分离D段，以得到该部分所有单体。方法：用葡聚糖凝胶柱分离十大功劳叶D段化学成分，然后用薄层层析法将含有相同物质的溶液合并，再用半制备型反相高效液相色谱法，收集对应峰的流出液。结果：最终分离制备得到3种单体。结论：该方法具有分离条件简单、快捷、周期短、目标产物纯度较高、收集全面等优点。但由于实验室条件有限，3种单体的定性工作需待研究。

关键词： 半制备高效液相色，十大功劳D段，化学成分

Abstract:. Objective: The chemical constituents of Mahonia bealei (Fort.) Carr. leaves is quite complicated. With effective means to separate the part D of it, we get all components. Method: The sephadex column was used to separate the chemical constituents of Part D of Mahonia bealei. Based on the thin layer chromatography method, the same composition was combined together. After analysis of Mahonia bealei by semi-preparative HPLC, the corresponding liquid was collected. Results: After a series of detections, 3 components was got at last. Conclusion: This method is of advantage by being efficient, simple with high purification. However, we can’t determine the chemical compositions of those 3components since the limit of the laboratory’s condition, it needs further study.

Keywords: PHPLC; Mahonia bealei (Fort.) Carr; chemical constituents;

目录

1 前言 5

1.1十大功劳属的化学成分研究进展 5

1.1.1 生物碱类化合物及非生物碱类化合物 5

1.1.2 药理作用 6

1.2 现代色谱分离手段 7

1.2.1 分离原理 7

1.2.2高效液相色谱分离特点 7

1.2.3 不同类型的液相色谱分离原理及其运用 7

1.3本实验的方法 8

2 材料与方法 8

2.1 材料 8

2.1.1 实验材料与试剂 8

2.1.2实验主要仪器 9

2.2 方法 9

2.2.1葡聚糖凝胶色谱法 9

2.2.2 薄层色谱法 10

2.2.3 HPLC对十大功劳D段成分分析 10

2.2.4 半制备高效液相色谱分离 11

3 结果与讨论 11

3.1葡聚糖凝胶色谱法分离结果 11

3.2 薄层色谱法分离结果 12

3.3高效液相分离结果 13

结论 16

致谢 18

1 前言

我国十大功劳属植物资源非常丰富，该属大多数植物是传统药或民间药，具有多种功效，如清热解毒、消炎镇痛等。基于功劳叶的一用功效，对其化学成分进行研究^[1]。

1.1 十大功劳属的化学成分研究进展

十大功劳属（Mahonia Nutt.）植物属于小檗科，灌木或小乔木，主要分布在北半球 的东南亚、中美洲等地区，全世界大概有100种^[2]，中国有35种左右。该属植物是一种非常普遍的观赏性植物，同时也是一种常见的药用植物。其根、茎、叶都可以作药，以根、茎作药的称为功劳木^[3]，以叶作药的称为功劳叶。我国民间药用已久，以阔叶十大功劳、华南十大功劳等品种较为常见^[4]，具有清热燥湿、泻火解毒、滋阴益肺、兼补肝肾之功效^[5]。

1.1.1 生物碱类化合物及非生物碱类化合物

从十大功劳属植物中可分离得到两大种主要成分，即生物碱成分和一些非生物碱成分。其中生物碱是十大功劳属植物的主要有效成分^[6]，也是目前十大功劳属植物中研究较为深入的一类化学成分。迄今为止，已经从十大功劳属植物中分离并鉴定出了25余种生物碱，主要为小檗碱、巴马汀、药根碱等^[7]。

国外学者他们对冬青叶十大功劳的研究比较深入，已经从它根、茎、叶和果实中分离得到18个生物碱左右，其中原小檗碱型5个、阿朴啡型6个、双苄异喹啉型7 个。

1960年，国内开始有关于十大功劳属植物成分研究的报道，周泽武教授从阔叶十大功劳根、茎中提取得到小檗碱，之后又相继有少量文献报道^[8]。丁朝武用PHPLC方法分离制备了红景天属植物提取物中苷的标准物, 标准品纯度由2左右提高到99以上^[9]。2003年，纪秀红等人从宽苞十大功劳茎的乙醇提取物中分离出、巴马汀、小檗碱、药根碱、异粉防己碱和木兰碱5个生物碱化合物^[10]。2011 年，樊丽博等人对细叶十大功劳茎叶的乙醇提取物进行萃取，后又经反复的硅胶柱、凝胶柱层析分离纯化出药根碱、小檗碱2 个生物碱，以及其他非生物碱组分。为了更加有效地控制十大功劳叶药材的质量，刘偲翔等首次用水蒸气蒸馏法从小果十大功劳枝叶提取出挥发油，又通过气相色谱-质谱联用（GC-MS）法^[11]鉴定其化学成分，后又用归一法测定各成分相对含量，最后确认主成分为棕榈酸（54.49%）。然而，同属植物阔叶十大功劳叶之挥发油成分却与其存在着较大差异，是可能产地不同、植物品种不同、提取方法不同所致。通过硅胶柱层析，卢文杰等从长柱十大功劳药材的石油醚部位前流份中，分离得到5种油状流份，他们采用GC-MS-DS（气相色谱-质谱-计算机联用技术)检出50个成分^[12]，鉴定出其中有41个成分，研究发现这些成分大多为脂肪烃类和脂肪酸类化合物，而且这些化合物都为首次从该植物中分离鉴定。

1.1.2 药理作用

十大功劳属植物的药理作用有很多，最主要的是抗菌作用。冬青叶十大功劳提取分出两种生物碱对9种不同的口腔细菌进行体外杀菌活性评价，结果显示两种提取物杀菌效果特别明显。有研究表明，该属植物还有保护肝脏的作用，当肝脏受损时，肝细胞中会释放出ALT和AST两种转氨酶，且水平会明显增高。阿里山十大功劳在台湾地区常作为一种护肝药，其提取物可有效降低ALT和AST水平。

1.2 现代色谱分离手段

“色谱法”是俄国植物化学家茨维特（Tswett）于1903年首次提出^[13]。是利用混合物中各组分在两相中分配系数不同，当流动相推动样品中的组分通过固定相时，在两相中进行连续反复多次的分配，从而形成差速移动，达到分离的方法。根据流动相的状态可分为气相色谱法和液相色谱法^[14]。在液相色谱中，采用颗粒十分细的高效固定相并采用高压泵输送流动相，全部工作通过仪器完成。这种色谱称为高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography HPLC）。

1.2.1 分离原理

高效液相色谱仪主要有储液罐、输液泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪，废液罐等7部分组成。储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数^[15]，在两相中作相对运动时，经过反复多次的吸附-解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别^[16]，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式打印出来。

1.2.2高效液相色谱分离特点

高效液相色谱法有“四高一广”的特点，即高压、高速、高效、高灵敏度、应用范围广。此外高效液相色谱还有色谱柱可反复使用、样品不被破坏、易回收等优点，但也有缺点，与气相色谱相比各有所长，相互补充。

1.2.3 不同类型的液相色谱分离原理及其运用

根据分离机制不用，高效液相色谱可分为四大基础类型：分配色谱、吸附色谱、离子交换色谱、凝胶色谱^[17]。

其中，分配色谱法是四种液相色谱法中应用最为广泛的一种。它类似于溶剂萃取，利用固定相与流动相之间对待分离组分子溶解度的差异来实现分离。一般将分配色谱法分为液液色谱和键合相色谱两类。液液色谱基于被测物质在固定相和流动相之间的相对溶解度的差异，分为正相色谱和反相色谱。键合相色谱法将固定相共价结合在载体颗粒上，克服了分配色谱中由于固定相在流动中有微量溶解，及流动相通过色谱柱时的机械冲击，固定相不断损失，色谱柱的性质逐渐改变等缺点。必须综合考虑固定相和流动相及溶质三者之间分子的作用力才能获得好的分离。分配色谱主要用于分离分子量低于5000，特别是1000以下的非极性小分子物质的分析和纯化，也可用于蛋白质等生物大分子物质的分析和纯化，但在分离过程中容易生物大分子往往比较容易变性失活。

吸附色谱法，常叫做液－固色谱法，它是基于在溶质和用作固定固体吸附剂上的固定活性位点之间的相互作用。可以将吸附剂装填于柱中、覆盖于板上、或浸渍于多孔滤纸中。

离子交换色谱法，是利用离子交换原理和液相色谱技术的结合来测定溶液中阳离子和阴离子的一种分离分析方法。现在它不仅适用于无机离子混合物的分离，亦可用于有机物的分离，例如氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子，

凝胶色谱法，是基于试样分子的尺寸大小和形状不同来实现分离的。由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果。凝胶色谱法又称分子排阻色谱法。

从应用的角度讲，以上四种基本类型的色谱法实际上是相互补充的。如今，高效液相色谱成为最为常用的分离和检测手段，在有机化学、生物化学、医学、食品科学、环境监测、商检和法检等方面都有广泛的应用。

1.3本实验的方法

本实验通过对阔叶十大功劳D段的分离，最终得到3个单体。先加甲醇溶解干燥待分离固体样品，依次经过硅胶色谱、凝胶色谱，将各成分分离开，再通过薄层色谱跟踪，最后再用半制备高效液相仪分离单体。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 实验材料与试剂

阔叶十大功劳(贵州省)；

甲醇为色谱纯（江苏汉邦科技有限公司）；

甲醇为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）；

二氯甲烷（上海久亿化学试剂有限公司）；

乙酸（南京化学试剂有限公司）；

超纯水为自制。

2.1.2实验主要仪器

1260高效液相色谱仪（美国Agilent公司），配备G1311A四元泵、G1315B紫外检测器、G131A自动进样器G1379A柱温箱、溜分收集器；

RE-3000D旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；

CBIO-UV6A多功能暗箱紫外分析仪（北京赛百奥科技有限公司）；

KQ-500B超声波清洗器；（昆山市超声仪器有限公司）；

硅胶板(青岛海洋化工厂)；

DHG-9240A电热恒温鼓风干燥箱（上海惊宏实验设备有限公司）；

EPED-T-60A超纯水仪（南京易普易达科技发展有限公司）。

2.2 方法

2.2.1 葡聚糖凝胶色谱法

装柱：将层析柱洗净，垂直固定在铁支架上。称取Sephadex LH-20约2g，在管口上放一漏斗，将其缓慢倒入，同时用橡皮塞轻轻敲击管柱，直到柱体不再下沉为止。加入甲醇（浓度为100%，以下均是），打开活塞，让溶液流出，排除残留气泡，再把收集的甲醇反复循环通过柱体几次，得到较紧密的柱体，最后保留约4cm高度的洗脱液^[18]。

加样：向干燥待分离固体样品中加入5ml的甲醇使之成为浓溶液。将柱内液面降到与柱面相齐时，关闭柱子。用滴管小心沿色谱柱管壁均匀地加到柱顶上。加完后，用少量甲醇把容器和滴管冲洗净并全部加到柱内，再用甲醇把黏附在管壁上的样品溶液淋洗下去。上样完成后静置约12h，各个组分由于分子量不相同，在凝胶柱上受到的阻滞作用不同，而在层析柱中以不同的速度移动。

洗脱：在柱顶上架一个带盖塞的倒置的长颈烧瓶，以便自动加液，随时添加甲醇，以保持液面的高度恒定。打开活塞，流速控制在5s/滴^[19]。仔细观察样品在层析柱内的分离现象，按色带分段收集洗脱液，每小瓶收集3ml左右（小瓶预先编号），至流出液基本无色，共收集19瓶。

洗脱完毕，采用薄层色谱法对各收集液进行鉴定，把含相同组分的收集液合并，除去溶剂，便得到各组分的较纯样品。

2.2.2 薄层色谱法

点样：先用铅笔在距薄层板一端近1cm处轻轻划一条线作为起始线，在这条横线上每隔7mm标一个点，总共14个。然后用毛细管吸取样品，在起始线上轻轻点样，斑点直径很小，基本没超过2mm，且没刺破薄层。第1~8样品瓶溶液颜色较深，只点一次，点完样后，用希尔球迅速吹干；第9~14样品瓶溶液太稀，需要重复点样。重复点样时，都是在前次点样的溶剂挥发掉点样的。

展开：将层析缸洗净，放在烘箱中烘干后取出待用，展开剂按V二氯甲烷：V甲醇=10：1配制。在层析缸中加入配好的展开溶剂 ，滴一滴乙酸，充分混匀，使其高度不超过1cm。将点好的薄层板小心放入层析缸中，点样一端朝下，浸入展开剂中。盖好玻璃板，粗糙的一面朝下。观察展开剂前沿上升到一定高度时，用镊子小心取出，尽快用吹风机吹干。吹干后，放在紫外分析仪下观察斑点位置[20]。

显色：先按V硫酸：V乙醇=1：1配制好显色剂，打开通风厨后，再把薄层板平整地放好，均匀地向薄层板喷显色剂，用吹风机紧贴着薄层板加热。

将含有相同组分的小瓶合并起来，得3组。打开旋转蒸发器，低速下，50℃水浴将第一组蒸干后，加2mL甲醇摇匀，转移至容量瓶中，标号“1”。第二组、第三组如是转移至容量瓶后，分别标号“2”、“3”。

2.2.3 HPLC对十大功劳D段成分分析

色谱条件：色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18分析柱（5μm,4.6×150mm）；进样量：5μL；流速：1.0mL/min；流动相：水—甲醇（40：60）；柱温：30℃；检测波长：218nm；

样品处理：取3个0.45μm微孔滤膜和3支一次性针管，将上步所得3组样品分别过膜，装入样品瓶中，分别标号“D1”、“D2”、“D3”，依次放入高效液相仪中，用100%甲醇冲洗柱子约10分钟，先对“D1”进行分析，进样量为5μL， 2分钟左右岀峰，出来两个峰。再对“D2”、“D3”分析

2.2.4 半制备高效液相色谱分离

制备型液相色谱法的效能取决于分离速度、分离度和上样量，提高效能就要求具有较快的分离速度和较大的上样量。按制备规模分，制备色谱可分为半制备色谱、克级制备色谱和工业制备色谱三大类。半制备色谱主要使用在所需样品量不是很大或者分离较困难的情况。严格地来说是一种放大的分析分离。

色谱条件：色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18分析柱（5μm,9.4×250mm）；进样量：100 μL；流速：2.0 mL/min；流动相：水—甲醇（40：60）；柱温：30℃；检测波长：218nm； 收集方式：手动收集。

2.3.5 收集液后处理

收集液用旋转蒸发仪旋转蒸干后，用少量100%甲醇将其溶解，并收集于样品瓶中，并编号。

3 结果与讨论

3.1葡聚糖凝胶色谱法分离结果

葡聚糖凝胶层析，是使待分离物质通过葡聚糖凝胶层析柱，各个组分由于分子量不同，在凝胶柱上受到的阻滞作用不同，而在层析柱中以不同的速度移动。分子量大于允许进入凝胶网孔范围的物质完全被凝胶排阻，不能浸入凝胶颗粒内部，阻滞作用小，随着溶剂在凝胶颗粒之间流动，一次流程短，而先流出层析柱；分子量小的物质可完全进入凝胶颗粒的网孔内，阻滞作用大，流程延长，而最后从层析柱中流出。若被分离物的分子量介于完全排阻和完全进入网孔物质的分子量之间，则在两者之间从柱中流出，由此就可以达到分离的目的。

如下图所示，用葡聚糖凝胶色谱法分离D段样品时，静置过夜，可明显观察到“D段凝胶上”样品颜色从深色到淡黄色再到无色，逐渐变浅。打开活塞，流速控制在5s/滴，最后收集到19个样品。由第2个样品瓶开始，颜色渐次变浅。

图 1葡聚糖凝胶分离D段

3.2 薄层色谱法分离结果

点样点1、2、3……14,分别对应样品瓶1、2、3、4……13、14，结果显示，点样点1-4的色谱条带较为相似，故将1-4合并为“D段凝胶-1”。点样点5-10的色谱条带较为相似，故将5到10合并，命名为“D段凝胶-2”。点样点10-14的色谱条带较为相似，故将11到19合并。

图 2 紫外分析仪254nm下显色

图 3 薄层色谱法D段样品显色

3.3高效液相分离结果

过凝胶后得到3个样品，“D段凝胶-1”样品制备得到两个成分；“D段凝胶-2”、 “D段凝胶-3”样品经高效液相分析后，其化学成分比较多，故将其合并后，再经硅胶柱层析得到“反凝胶-1”、“反凝胶-2”、“反凝胶-3”共3个组分，经高效液相仪分析，“反凝胶-2”为一单体，“反1段”和“D段凝胶1-1”是同一物质，“反凝胶-3”和“D段凝胶1-2”是同一物质。

图 4半制备HPLC分离D段

先用分析柱对分别对“D段凝胶-1”、“D段凝胶-2”和“D段凝胶-3”三个样品进行分析，得到“D段凝胶-1”的色谱图如下。有2个峰，岀峰时间较短，容易制备。

图 5 “D段-1”半制备高效液相色谱分析

“D段凝胶-2”、“D段凝胶-3”段合并后，得到3个组分，经高效液相仪分析，分别得到的色谱图6、7、8，如下：

图 6 “反凝胶-1”半制备高效液相色谱分析，甲醇-水（60：40）

图 7 “反凝胶-2”半制备高效液相色谱分析，甲醇-水（60：40）

图 8 “反凝胶-3”半制备高效液相色谱分析，甲醇-水（70：30）

由图6、图7、图8所知，图7有两个明显的峰，即2种不同的物质，可进一步制备；分析比较图6和图8，得到“反凝胶-1”和“D段凝胶-1”为同一物质，故可将他们合并；“反凝胶-3”和“D段凝胶-2”为同一物质，故也可以将他们合并。

接着用制备柱进行对“D段凝胶-1”、“反凝胶-2”样品进行制备时得到的图谱。

如图表9所示，峰1、2分别与图5中的峰1、2对应，用制备柱制备，手动收集，分别将收集液装入标好号的1、2两个烧杯中，收集完毕后，分别经旋转蒸发水浴蒸干，加少量甲醇转移至2个样品瓶中，放入冰箱中。

图10中峰1，2分别与图表6中的峰1,2对应。用制备柱制备，同样手动收集，最终经浓缩后得到单体。（进样量为100μm）

图 9 “D段凝胶-1”半制备高效液相色谱，甲醇-水（58：42）

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