glgB/GASBD基因在马铃薯中的表达对淀粉分支程度的影响

论文总字数：14621字

摘 要

本研究是以马铃薯栽培品种Desiree的转基因株系为材料进行研究。首先对转基因马铃薯植株进行PCR检测，结果发现融合基因已经整合到马铃薯基因组中。然后通过RT-PCR分析和Western斑点杂交分析对转基因马铃薯植株进行检测，结果表明glgB/GASBD融合蛋白可以在淀粉生物合成中结合到淀粉颗粒中，并且glgB/GASBD融合蛋白具有很高的淀粉亲和性。最后用DNS法测定转基因马铃薯淀粉的分支程度，结果发现，glgB/GASBD融合基因在马铃薯块茎中的表达能使转基因淀粉的分支化程度增加35%。

关键词：转基因马铃薯，glgB/GASBD融合基因，PCR，分支程度

Abstract: The transgenic plants of potato cultivars Desiree were used as the materials in this study. The results of PCR detection of the transgenic potato showed that the fusion gene had been integrated into the potato genome. Then the transgenic potato plants were analyzed by RT-PCR and Western dot blot, and the results show that glgB/GASBD fusion proteins can be integrated into the starch in the starch biosynthesis, and glgB/GASBD fusion protein had high affinity with starch. Finally, the starch branching degree of transgenic potato were analyzed by DNS method, and the results showed that the expression of glgB/GASBD fusion genes in the tubers of potato results in the starch branching degree had increased up to 35%.

Keywords: Transgenic potato， glgB/GASBD fusion gene，PCR，the degree of branching

目录

前言 4

1 材料与方法 5

1.1材料 5

1.1.1植物材料 5

1.1.2 酶与试剂 5

1.2方法 5

1.2.1 转化植株的PCR检测 5

1.2.2 基因表达的半定量RT-PCR分析 6

1.2.3 马铃薯淀粉的提取 6

1.2.4 Western斑点杂交分析 6

1.2.5 转基因淀粉葡萄糖当量值(DE值)的测定 7

2 结果与分析 7

2.1 转化马铃薯植株的分析 7

2.1.1 PCR分析 7

2.1.2 半定量RT-PCR分析 9

2.1.3 Western斑点杂交分析 10

2.2 转基因对淀粉分支程度的影响 12

结论 14

参考文献 15

致谢 16

前言

淀粉的冻融稳定性是淀粉的一项重要功能性质^[1]，主要是由直链淀粉/支链淀粉的比例和支链淀粉的分支化程度决定的，并且与高度分支化的且含有更多短链的支链淀粉相比，直链淀粉具有更高的老化倾向^[2]，无直链淀粉比含有直链淀粉的淀粉具有更好的冻融稳定性。要改善马铃薯淀粉冻融稳定性的一种有效方法就是利用基因工程手段改变淀粉组分（直链淀粉和支链淀粉）的结构，从而有更高的淀粉分支程度。理论上，想获得具有更高冻融稳定性的淀粉，可以缩短直链淀粉长链和支链淀粉的分支链长度、增加支链淀粉的短分支链数量。比方说，运用反义抑制的方法同时下调3个淀粉合成酶基因（GBSSI，SSII和SSIII）在马铃薯中的表达，导致支链淀粉的分支链长度减少，最后获得了一个冻融稳定性显著改善的马铃薯淀粉^[2]。Kortstee等(1996)报道在马铃薯突变体(amf)中异源表达大肠杆菌糖原分支酶(g1gB)基因，结果发现支链淀粉的分支化程度增加25%^[3]。

为了在植物体内生产出分支化程度得到进一步提高的淀粉，从而改善淀粉的冻融稳定性，将大肠杆菌糖原分支酶(glycogen branching enzyme,glgB)基因融合到黑曲霉GASBD基因的5′-末端或3′-末端，并将合成的这两个融合基因转化到马铃薯栽培品种Desiree中。在本研究中，主要对glgB/GASBD融合基因以及glgB基因在马铃薯中的表达对淀粉分支程度的影响进行研究。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1植物材料

三个马铃薯转基因系列：分别为glgB-GASBD、GASBD-glgB和glgB转基因系列。

1.1.2 酶与试剂

反转录试剂盒购自Invitrogen 公司(美国)；直链、支链淀粉标准品和异淀粉酶购自于Sigma公司(美国)；β-巯基乙醇；氯仿；异丙醇；乙醇；TE缓冲液；Mini Trans-Blot System (Bio-Rad，美国)；硝酸纤维素膜(Milliper公司，美国)； TTBS缓冲液；TBS缓冲液；3,3"-二氨基联苯胺四盐酸。

1.2方法

1.2.1 转化植株的PCR检测

通过CTAB法^[4]提取转化植株和对照植株的叶片基因组DNA(叶片取自于70天的盆栽苗)。首先取100 mg 新鲜的马铃薯叶片，用液氮冷冻研磨成粉末，加入500µL 65℃预热的CTAB 抽提液(2% CTAB，1.4M NaCl，20 mM EDTA，100 mM Tris-HCl)和10µL β-巯基乙醇，轻轻混匀后放入65℃水浴保温30 min，加等体积的氯仿：异戊醇(24:1)混合液，进行混匀，在4℃，13 000g离心5 min，然后取300µL上清液以及加入300µL预冷的异丙醇，静置20 min，13 000g离心10 min，最后沉淀用70%乙醇清洗2次，置于室温干燥后，在30μLTE缓冲液中溶解。

按照大肠杆菌glgB基因序列，用Primer 5.0软件设计一对特异性引物，引物序列分别是：5"–GGGATTCTTTAGCGGCGTCATTC–3" 和5"–ATCAGCACCGAGCGTTCTTTGTC–3" ，预期扩增片段大小为1720 bp。PCR反应体系是：基因组DNA 2μL，引物各1μL，2.5 mM dNTPs 2μL，10×PCR反应缓冲液2.5μL，Taq酶1μL，加双蒸水到25μL。PCR反应程序为：95℃ 4 min，95℃ 60 s，52℃ 45 s，72℃ 90 s，35个循环，72℃延伸10 min。

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