葡萄籽原花青素对人肝癌HepG2细胞抗增殖活力研究

论文总字数：12554字

摘 要

本研究探讨葡萄籽原花青素对人肝癌HepG2 细胞增殖的抑制作用及其对相关蛋白表达量影响。将葡萄籽原花青素用逐渐增高的浓度（0、 12.5、 25、 50、 100μg/mL）分别与人肝癌HepG2 细胞反应24 h，同时与反应时间为48 h做对照，采用MTT 染色法检测葡萄籽原花青素对人肝癌HepG2 细胞的毒性，以此分析其抗增殖、抗侵袭作用；将葡萄籽原花青素用逐渐增高的浓度（0、10、20、30、40、50μg/mL ）作用于人肝癌HepG2 细胞48 h后，用流式细胞仪对细胞进行凋亡、坏死定量分析；Western 蛋白印迹法检测葡萄籽原花青素对人肝癌HepG2 凋亡信号通路的影响。实验结果表明：葡萄籽原花青素对人肝癌 HepG2 细胞有十分显著地增殖抑制、侵袭抑制的作用，24 h的IC₅₀ 为(135.21±0.34) μg/mL，48 h的IC₅₀ 为(65.44 ± 0.27) μg/mL；当50μg/mL原花青素与人肝癌HepG2 细胞反应24 h后，活细胞率显著减小，由 (94.8±1.31)%减小到(53.70±1.14)%，而细胞的凋亡比例由(1.23±0.95)%增至(13.7±2.79)%，(P lt; 0.01)，细胞坏死率则无明显差异；200μg/mL原花青素处理人肝癌HepG2 细胞（0、1、3、6、12) h 后，抑制了JNK 、ERK 、AKT 和IkBα 蛋白的表达，呈现明显的时间依赖关系。

关键词：葡萄籽原花青素，细胞毒性，细胞凋亡，信号通路，蛋白表达

Abstract: The objective of this study was to investigate the toxicological effect of grape seed procyanidin extract（GSPE）on the growth of human normal liver cells HepG2 and the effect on the amount of related protein expression. After cells were treated with PCs 0,12.5,25,50,100μg·mL^{- 1} for 24 or 48 h，cell viability was examined using MTT assay. After cells were treated with PCs 0,20,30,40,50μg·mL^{- 1} for 48 h apoptosis were analyzed by flow cytometry. Apoptosis pathways were detected by Western blotting. Results said that PCs exhibited a strong inhibitory effect on HepG2 in a concentration-dependent and time-dependent manner. IC₅₀ of PCs treatment for 24 or 48 h was (135.21 ± 0.34) μg·mL^{- 1} and (65.44 ± 0.27)μg·mL^{- 1},respectively. After cells were treated with PCs 50 μg·mL^{- 1} for 24 h, cell viability was decreased from (94.8±1.31)% to (53.70±1.14)%,while the cell apoptosis rate was increased from (1.23±0.95)% to (13.7±2.79)%，(P lt; 0.01), the cell necrosis rate was no significant difference; After cells were treated with PCs 200μg·mL^{- 1} for 0、1、3、6、12 h, the expression of JNK、ERK、AKT and IkBα was examined significantly decreased by PCs, showing obvious time dependencies.

Key words: grape seed procyanidin extract（GSPE）, cytotoxicity, apoptosis, signal path, protein expression

目录

摘 要 3

Abstract. 4

Key words 4

1前 言 7

1.1 原花青素概述 7

1.2 原花青素的生物功能 7

1.3 研究现状 8

1.4 本实验的研究目的和意义 8

2材料与方法 8

2.1材料与试剂 8

2.2仪器与设备 9

2.3试验方法 10

2.3.1细胞培养及处理 10

2.3.2原花青素对肝癌 HepG2 生长增殖的抑制作用 10

2.3.3Annexin V-FITC /PI 双染色流式细胞仪检测细胞凋亡 11

2.3.4 人肝癌 HepG2 细胞蛋白印迹分析 11

3.结果与讨论 12

3.1原花青素对肝癌 HepG2 细胞增殖的抑制作用 12

3.2倒置显微镜观察细胞形态学变化 13

3.3Annexin V-FITC/PI 双染色检测 HepG2 细胞凋亡和坏死 13

3.4 Western blot 法测MAPKs/Akt途径相关蛋白的表达量 14

结论 16

参考文献 17

致谢 19

1. 前 言

1.1 原花青素概述

原花青素，(简称PCs),它属于生物类黄酮物质，正是由于其有着特殊化学结构，它才有着十分强大的生物活性。最简单的原花青素是儿茶素、表儿茶素或儿茶素与表儿茶素形成的二聚体，此外还有三聚体、四聚体直至十聚体。原花青素分子结构中有多电子的羟基，8个酚羟基（儿茶素）与双键共轭，为氢原子的供体，且芳环上的共轭键使电子在分子中稳定，2个脂肪族羟基使其具有良好水溶性，这些分子结构特点使其具有良好的清除自由基和抗氧化的活性。^[1]

图1 原花青素结构图

原花青素在葡萄、山楂、松树皮、可可豆、贯叶金丝桃、野生刺葵、番荔枝、野草莓等植物中含量丰富^[1]，随后又在地榆根、花生等植物中发现有原花青素的成分存在，^[2]经过对原花青素含量的测定，大量的数据证明，在松树皮和葡萄籽中，原花青素含量最高。^[3]在本研究中，实验所用葡萄籽原花青素是标准品配制的溶液，没有自行提取，其中原花青素的质量分数大于95%，其性状为棕红色粉末。

1.2 原花青素的生物功能

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