拟南芥剪接因子RID1相互作用蛋白筛选

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摘 要

真核生物中，基因转录后内含子的剪接是由剪接复合体催化完成的。剪接复合体的组装需要多个蛋白质间的相互作用实现其动态组装的过程。前期研究报道，RID1作为剪接复合体组分参与前体mRNA的剪接。但是，RID1如何参与剪接复合体组装的机制还不清楚。我们利用RID1作为诱饵蛋白，进行酵母双杂交筛选，最终筛选到SKIP蛋白。本研究利用构建的AD-RID1和BD-SKIP进行酵母双杂交验证，结果显示AD-RID1和BD-SKIP存在直接的相互作用。SKIP作为剪接复合体亚复合体B复合体的组分，其可能通过与RID1相互作用招募其进入剪接复合体，为解析剪接复合体的动态组装提供理论依据。

关键词：酵母双杂交、蛋白质相互作用、剪接复合体、拟南芥Abstract：Pre-mRNA splicing is catalyzed by spliceosome in eukaryotes. Multiple interactions among proteins facilitate the dynamic assembly of spliceosome. In previous report, RID1 functions as a splicing factor in Arabidopsis. However, how RID1 is recruited into the splice some is unknown. To elucidate the concern, we conducted a yeast-two-hybrid screen and isolated the interacting protein SKIP. In this study, we introduced RID1 into pGADT7 and SKIP into pGBKT7 and verified the direct interaction between RID1and SKIP by yeast-two-hybrid assay. SKIP, a component in B complex, may recruit RID into spliceosome by direct interaction, which provided important information for spliceosome dynamic assembly.

Key words ：Yeast two-hybrid, protein interaction, spliceosome, Arabidopsis thaliana

目录

1 前言 1

1.1剪接复合体的研究 1

1.1.1前体mRNA的剪接概念 1

1.1.2剪接复合体简介 1

1.1.3选择性剪接 1

1.2RID1参与前体RNA剪接 3

1.2.1 RID1参与雌配子体发育的研究 3

1.2.2 RID1的剪接活性研究 3

1.3酵母双杂交技术 4

1.3.1酵母双杂交原理 5

1.3.2酵母双杂交应用 5

2.材料与方法： 5

2.1实验材料与试剂 5

2.2过程方法 5

2.2.1 RNA提取 5

2.2.2 反转录 6

2.2.3 PCR技术 6

2.2.3.1利用PCR技术扩增基因 7

2.2.3.2 PCR产物的胶回收 7

2.2.4 质粒提取 8

2.2.5 酵母双杂交 8

3结果： 9

3．1 AD-RID1重组子的构建 9

3.1.1 RID1基因的扩增 9

3.1.2 AD-RID1重组子的鉴定 10

3.2.BD-SKIP重组子的构建 11

3.2.1 SKIP基因的扩增 11

3.2.2 BD-SKIP重组子的鉴定 12

3．3 酵母双杂交 12

4.结论 13

5参考文献 14

1 前言

1.1剪接复合体的研究

1.1.1前体mRNA的剪接概念

遗传信息就像一个司令部，存在许多指令需要交给下面的蛋白质去执行，但指令本身又比较冗杂，既包括有用信息，又含有无用信息，而剪接体的作用就是“把没用的信息去除掉，把有用的信息拼接起来”。

真核生物中，细胞核内初始转录物通过切除内含子、连接不连续的外显子等程序以形成成熟的mRNA，这一系列的步骤综合称为前体mRNA的剪接。经过剪接的成熟的mRNA在核糖体内翻译成蛋白质，进而发挥其生物学功能^[1]。

1.1.2剪接复合体简介

真核生物的基因，主要是通过剪接复合体的催化来完成其前体mRNA的剪接。随着前体mRNA的转录，剪接复合体组分和snRNA在完整的前体mRNA 上富集^[2]。剪接复合体主要是由蛋白质构成，其中某些功能的实现也需要某些小分子的核RNA的辅助。然而，部分小核RNA的参与虽然是剪接体的剪接过程本身所需要的，这对于基因的正常表达起到重要的调节作用，但这些小核RNA本身并不会表达出任何有效的功能蛋白质。值得一提的是，剪接复合体的构象和组成并不是持续稳定的、不变的，而是高度动态的、有序的，以保证剪接的准确性和柔韧性^[3]。

根据相关资料分析，剪接体的装配与核糖体的装配机理相似，但是比核糖体更复杂，两者相似点主要包括：依靠蛋白质与蛋白质、RNA与蛋白质、RNA与RNA等三方面的相互作用。

1.1.3选择性剪接

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