利用巴斯德毕赤酵母制备甘露聚糖的工艺优化

论文总字数：10456字

摘 要

本实验主要对各种影响重组巴斯德毕赤酵母碱提取甘露聚糖的产量的因素进行了探究，对制备条件进行了优化。首先进行单因素试验，主要研究了碱浓度、时间、温度以及料液比这四种条件对制备甘露聚糖的影响。接下来通过正交试验，优化了四种影响甘露聚糖制备的条件。最终优化结果表明，从重组巴斯德毕赤酵母中碱提取甘露聚糖的得率最高时，最佳条件为：料液比为12.5%，时间为2小时，碱浓度为4%，温度为90℃。在最佳因素下进行多次试验，从重组巴斯德毕赤酵母中制备甘露聚糖的得率约为 5.7%。

关 键 词：重组巴斯德毕赤酵母；甘露聚糖；提取工艺

Abstract: In this experiment, the conditions of preparation of manganosaccharide from the recombinant Pasteur pichia were studied and optimized. First NAOH concentration was studied by single factor experiment, time, temperature and concentration of reorganization Pasteur pichia this four factors influence on the preparation of mannan, then through the orthogonal experiment analysis on the influencing factors of mannan preparation is optimized, the optimization results show that reorganization Pasteur pichia extracted mannan of optimum technological conditions for: NAOH concentration was 4%, the time is 2 h, the temperature is 90 ℃, reorganization Pasteur pichia concentration 12.5%. In the optimum process, the extraction rate of mannitol from the recombinant pasteubicin yeast was about 5.7%.

Keywords：Recombinant Pasteur pichia yeast; Mannose polysaccharide; Extraction process

目录

1 前言 6

1.1甘露聚糖概述 6

1.2巴斯德毕赤酵母概述 6

2 材料与方法 7

2.1 材料 8

2.1.1 实验材料 8

2.1.2 仪器 8

2.1.3 培养基 8

2.2 方法 8

2.2.1重组巴斯德毕赤酵母的活化培养 8

2.2.2重组巴斯德毕赤酵母的扩大培养与发酵 8

2.2.3配置酵母悬浮液 8

2.2.4甘露聚糖的分离 9

2.2.5甘露聚糖的烘干 9

2.2.6甘露聚糖含量的测定 9

2.2.7重组巴斯德毕赤酵母甘露聚糖提取条件优化的试验设计 9

3 结果与讨论 10

3.1 NaOH 溶液浓度的选择 10

3.2 提取时间的选择 10

3.3 提取温度的选择 11

3.4 酵母浓度的选择 12

3.5 提取条件的优化 13

3.6 优化条件的验证 15

结论 16

参考文献 17

致谢 19

1 前言

1.1甘露聚糖概述

Mannan酵母细胞壁包裹在一层胶体糖蛋白中，以α-（1，6）糖苷键形成的D - mannose 为主链^[1-2]。甘露聚糖不仅是一种对人体和动物有益的食品添加剂，同时也是一种非常具有市场潜力的动物饲料添加剂。甘露聚糖作为一种免疫作用最好的多糖，它可以使动物和人体的细胞免疫以及体液免疫的能力显著提高。甘露聚糖能够调节人体肠道，选择性吸收了大量的霉菌毒素，特别是对富马毒素、T 2毒素、玉米赤霉素等有毒物质，以及不可逆化合物的形成，然后随着动物的粪便排泄到体外，避免霉菌毒素对动物身体的危害^[3]，并具备抗辐射、抗氧化、抗肿瘤等多种活性功能^[4-7]，是一种经济有效的天然防腐剂，无色、无毒、无气味，能有效避免食品腐烂、霉变和虫害。在动物体外发现 TNF-α，它具备直接溶解肿瘤和控制增殖的活性功效，能够在体内导致肿瘤的坏死，从而使肿瘤的体积变小甚至消退^[8-9]。

国外研究人员用干魔芋粉作为原料，用甲醇、乙醇或丙酮等极性溶液提取分离。它也可以从天然材料如椰子和海藻中提取。

在保存和储存水果、蔬菜、豆制品、鸡蛋和鱼等食物时，甘露聚糖还发挥着巨大的作用。使用时可以将甘露聚糖配成0.05%到1%的溶液，然后用喷雾、浸渍或涂布等方法来覆盖新鲜的食物。mannose的原材料非常丰富，在具有明显的功能与资源上的优点，而且对牙齿有益，同时也适合于三高人群的服用，含有高纤维和低热量的食物，可以用作老年人和糖尿病患者的食物添加剂。并且，由于其稳定的理化性质，能够大规模的应用于各种食品和饮料中，并有望研究出新的保健食品或药品。

1.2 重组巴斯德毕赤酵母概述

作为当前最有效、运用最普遍的基因表达体系之一——毕赤酵母（Pichia pastoris）表达体系，目前有许多酶类，如甘露聚糖酶、木聚糖酶、植酸酶等都能够在毕赤酵母的表达体系中获得高效表达^[10]。

20世纪80年代，单细胞蛋白(SCP)可以通过巴斯德毕赤酵母制备，这种酵母有着非常好的发酵基础。其产生的菌体密度能够达到每升100克的干重。巴斯德毕赤酵母可以在无机盐、微量元素、生物素、氮源和碳源生长介质等多种成分中生长，这种物质价格低廉且对人体无毒害作用。它生长介质也可以是甲醇，代谢途径中的关键酶可以达到巴斯德毕赤酵母细胞中可溶蛋白的百分之三十。当采用乙醇、甘油或者葡萄糖作为碳源时，可吸收卤化物未出现在培养细胞中。因为主要是在转录水平调控可吸收卤化物的合成。

当采用培养、转化、高密度发酵等方法处理巴斯德毕赤酵母时，处理方法与原核生物十分相似，相对于真核系统来说较简单，非常适宜运用于广泛的工业化生产中。巴斯德毕赤酵母可以在十分廉价的发酵培养基生长，所生成的产物易于处理分离，可以使用甲醇或葡萄糖和甘油作为一般碳源，同样无机盐也可以作为其生长的碳源。而且巴斯德毕赤酵母生长的培养基中没有蛋白，这样在进行实验时可以分离纯化下游产品。而在酿酒酵母中所采用的诱导剂通常选用高价半乳糖。所以本实验中制备甘露聚糖的原料选择废弃重组巴斯德毕赤酵母。

巴斯德毕赤酵母中的甘露聚糖具有调节动物和人体的免疫功能,能够改善肠道健康，对病原微生物的选择性吸附,以及吸附霉菌毒素和其他的功能,所以这是一种非常具有潜在市场的绿色饲料添加剂，同时也是一种食品添加剂。一般采用酸法以及碱法制备酵母多糖^[11-13]。综合利用巴斯德毕赤酵母方法的探索，并进行相干产品的研发具有十分重要的意义，从而使这些酶类能够大范围工业化生产。

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