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摘 要

根据菌株离体条件下耐受镉离子活性，从课题组菌株资源库中选择了5株能够降低培养液中镉离子浓度29%-51%的菌株进行温室实验，评价其协助寄主植物缓解镉胁迫压力的能力。其中菌株1JN2在镉离子处理条件下能够增强寄主植物的耐受性，与空白对照相比根长增加21-28%；鲜重增加19-32%；叶绿素含量增加11-20%；根系活力增加363-526%，并且降低植物组织中镉离子浓度23-40%。 通过扫描电镜发现该菌株在镉离子处理后24h开始能够进行自我复原并且在48h出现胞外多糖固化现象。通过形态学特征及16S rDNA序列比对，鉴定该菌株为Bacillus subtilis。

关键词：植物根围细菌，镉胁迫，ICP，扫描电镜，枯草芽孢杆菌

Abstact: Based on the in vitro tolerance activity against Cd² , 5 strains which reduced Cd² by 29%-51% in medium were selected from our rhizobacteria library and evaluated their ability to help host plant to alleviate Cd² pressure in greenhouse. Among them, 1JN2 showed significant activity to help host plant to alleviate drought pressure compared with the untreated control, with a 21-28% increase in root length, a 19-32% increase in fresh weight, an 11-20% increase in chlorophyll content, a 363-526% increase in root activity. In addition, 1JN2 reduced Cd² content in the plant tissue by 23-40%. Based on the SEM results we can indicated that 1JN2 began to self healing on 24h after treated by Cd² and the exopolysaccharides began to solidified on 48h post treated. According to the morphological feature and 16S rDNA sequence blast results, 1JN2 was identified as Bacillus subtilis.

Keywords: rhizobacteria, Cd² , ICP, SEM, Bacillus subtilis

目 录

1 前言 4

2 材料与方法 5

2.1 离体条件下菌株耐镉活性检测 5

2.2 盆栽条件下耐镉菌株的活性评价 5

2.3 温室实验植株生理指标检测 5

2.4 耐镉菌株的鉴定 6

2.5 耐镉菌株镉离子耐受机制检测 6

2.6 数据分析方法和软件 6

3 结果与分析 6

3.1 离体条件下菌株耐镉活性检测结果 6

3.2 耐镉菌株温室评价实验结果 7

3.3 耐镉菌株鉴定结果 10

3.4 耐镉菌株镉离子耐受机制检测结果 10

4 讨论 11

结 论 13

参考文献 14

致谢 16

1 前言

随着工业化进程的加快和人口的持续增长，重金属污染已成为全球性的问题。农用土壤是受人类活动强烈影响的一类特殊土壤，其环境质量与人们的身体健康密切相关^[1]。土壤污染源主要来自工业“三废”和农药、化肥的大量使用，污染物可通过灌溉水进入土壤，也可通过大气污染、空中的颗粒物(含重金属和致癌物质等)干湿沉降造成土壤污染，随着时间的推移，农田表层土壤镉、铅、铜、锌等重金属含量有增加的趋势^[2]。由于农作物的吸收作用，重金属元素从土壤中迁移转化到农作物根茎叶及果实中去，从而连带造成农作物的重金属污染，危及人们的健康水平。其中镉已经成为威胁农业生产的罪魁祸首。全球每年释放到环境中的镉高达3.9 ×10⁴ t^[3]。而在环洪泽湖地区造成污染的几种重金属当中，镉的污染程度也要高于其他几种^[4]。镉污染给种植业带来的损失非常严重，更重要的是这些受镉污染的农产品对于人类健康的影响是无法衡量的。镉中毒可使肌内萎缩关节变形，骨骼疼痛难忍，不能入睡，发生病理性骨折，以致死亡。因此，如何修复这些受到镉污染的土地和水体已经是我们急需面对的问题。

目前，对于重金属污染所采用的修复手段包括：工程修复、电动修复、电热修复、土壤淋洗以及化学修复，这些方法虽然在一定程度上能够缓解重金属污染，但是却存在着一些弊端：如实施工程量大、投资费用高，破坏土体结构，引起土壤肥力下降，并且还要对换出的污土进行堆放或处理，其中化学修复只是改变重金属的存在形态，并不能彻底根除，还存在再度活化污染的可能。另外，通过一些特定植物对金属离子的提取、挥发以及稳定等特性也可以进行重金属污染修复。这种生物修复方式由于效果好、易操作等特点已经收到越来越多的重视。但是却只是用于非耕作土壤或水体的修复，对于农田重金属污染依然无能无力^[5]。

利用自然环境中分离得到的有益微生物来修复农田及水体的重金属污染就可以克服这一困难^[6]。受到重金属污染的土壤，往往富集多种耐重金属的真菌和细菌，微生物可通过多种作用方式影响土壤重金属的毒性^[7-8]。如魏本杰等人报道，产铁载体细菌可以活化土壤中的镉^[9]。周小梅等人也报道了一株具有较强产酸能力的芽孢杆菌，该菌株除对镉有耐性之外，对铅、铜等均具有一定耐受性^[10]。除此之外，植物内生菌作为与植物关系紧密的重要微生物资源，也有研究人员研究其在修复重金属污染中的作用。如曹喆等人从重金属镉（Cd）超累积植物龙葵中分离到一株芽孢杆菌能够去除镉离子^[11]。另外，姜敏等人报道从重金属富集植物（大叶相思）与非富集植物（水禾、水稻）中分离的重金属抗性真菌均高于根际真菌^[12]，也说明了内生菌在在重金属修复中的巨大潜力。以往报道中对于镉污染的微生物修复侧重点在于土壤中镉的活化，然后通过微生物-植物进行联合修复，但是该方法在耕地重金属修复中却存在一定弊端。因此，寻找一种能够有效降低环境中镉离子浓度从而减少农作物吸收积累的修复方式，对于日益严重的耕地重金属污染来说意义重大。

本研究旨在通过离体条件下菌株耐受镉离子活性筛选，选择能够耐受并且降低环境中镉离子浓度的菌株进行温室评价实验，并且探讨其降低镉离子浓度的机制。旨在寻找一条能够降低农业生产中镉污染危害的途径。

2 材料与方法

2.1 离体条件下菌株耐镉活性检测

将活化后的菌株接种到含有终浓度为15mg/L硫酸镉的LB培养液中（培养液配制用水为去离子水），28℃，180 rpm摇床培养24h。分别从培养后的培养液中吸取2mL 在600nm 下检测其吸光值，以此判断菌株生长情况。另取1mL 培养液离心后取上清液进行消化用以测定其中镉离子浓度，消化方法如下：1mL 上清液中分别加入9mL 去离子水，转移至50mL 小烧杯中，加入浓硝酸1mL，80℃水浴，蒸发至1mL左右再加入浓硝酸1mL、高氯酸0.5mL。混匀后继续水浴蒸发至1mL，冷却，加入4mL去离子水，混匀后利用原子发射光谱法（ICP）测定其中镉离子浓度。

2.2 盆栽条件下耐镉菌株的活性评价

温室实验共进行2批次，所用寄主植物分别为黄瓜和辣椒，品种分别为“新津优1号”和“大禹牛角王”，所用基质购自淮安市柴米河农业科技有限公司。首先用穴盘育苗，待苗长出3-4片真叶后移栽到盆钵中，每盆1株。盆钵高10cm，口径12cm，每盆装基质400-500g。温室条件设定为：30℃，光照时间16h，黑暗时间8h。

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