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摘 要

利用镉胁迫后的超积累生态型东南景天作为材料，提取总RNA，通过改良SMART技术合成其全长cDNA,回收750 bp以上片段克隆到植物表达载体pBI121GB中，建成东南景天镉胁迫全长cDNA植物表达文库。对随机挑取的阳性克隆进行PCR鉴定，插入片段多为1000 bp以上，证明所构建的文库达到了用于目的基因分离筛选的要求。将连接有东南景天全长cDNA文库的载体转化农杆菌后，借助于农杆菌介导的拟南芥浸花转化体系，转化野生型拟南芥，获得包括插入片段cDNA的转基因拟南芥。克隆转基因拟南芥所携带的目的基因并进行初步的生物信息学分析，为筛选出东南景天cDNA中镉抗性相关基因提供分子资源。

关键词：东南景天 ，cDNA文库， 基因筛选

ABSTRACT：After using cadmium hyperaccumulating ecotype of Sedum for the material extracted total RNA, full-length cDNA was synthesized by modified SMART Technologies, recycling more than 750 BP fragment cloned into plant expression vector pBI121GB, and built plants Sedum CD full length cDNA expression library. PCR identification of randomly picked clones,length than 1000 bp were got, demonstrate that the library reached for the construction of target gene screening requirements.after Sedum is connected with full length cDNA library of Agrobacterium transformants, by means of Agrobacterium-mediated dipped flowers in Arabidopsis transformation system, transformed wild-type Arabidopsis thaliana, the transgenic Arabidopsis was obtained including the insertion fragment cDNA. Cloned transgenic Arabidopsis carrying the gene and preliminary bioinformatics analysis, provided molecular resources for the screened genes related to cadmium resistance cDNA in s.alfredii.

Keywords：S. alfredii Hance,cDNA Library,gene screening

目录

1 前言 - 3 -

2 材料与方法 - 5 -

2.1实验材料与试剂 - 5 -

2.1.1植物材料 - 5 -

2.1.2酶和主要试剂 - 5 -

2.1.3菌株与质粒： - 5 -

2.1.4培养基 - 5 -

2.2实验方法 - 6 -

2.2.1东南景天全长 cDNA 文库构建 - 6 -

2.2.2 东南景天全长cDNA过表达文库转化拟南芥 - 9 -

2.2.3 东南景天cDNA中耐镉基因的筛选 - 11 -

3 结果与分析 - 12 -

3.1 mRNA 提取结果分析 - 12 -

3.2 全长 cDNA 合成与分级分离 - 13 -

3.3 文库的转化和鉴定 - 14 -

3.4 拟南芥的遗传转化 - 16 -

3.5 转基因植株的分析 - 17 -

3.5.1 转基因植株的 PCR 鉴定 - 17 -

3.5.2 转基因植株中东南景天耐镉基因的分离与测序 - 18 -

结论 - 18 -

参考文献 - 20 -

致谢 - 21 -

东南景天cDNA耐镉基因的筛选

1 前言

随着工业化进程的加快，我国土壤重金属污染日趋严重。据报道，目前我国受镉、砷、铬、铅等重金属污染的耕地面积达到2000万hm²，约占总耕地面积的1/5，全国每年因重金属污染而导致的粮食减产多达1000多万吨，^[1]由此造成的经济损失难以估量。我国南方地区重金属污染尤其是镉污染非常普遍，镉离子具有强植物毒性，会抑制植物的生长甚至使其死亡。Cd是毒性最强的重金属之一。作为一种痕量重金属元素，Cd在未污染土壤中主要来源于其成土的母质，一般情况下其含量较低。但由于大气沉降、采矿、冶炼、工业废物排放、污灌、施用污泥及磷肥等自然及人为因素的影响，加快了Cd进入土壤的速度，而Cd在土壤中又具有稳定、易积累和不易消除的特点，因此土壤环境中的Cd具有长期积累和富集的趋势。^[2]随着环境中Cd污染范围的扩大和强度的增加，被生物有机体吸收富集的量也相应增大，既可以直接对植物造成不同程度的生理伤害甚者致死，又可以随着食物链的逐级放大作用使食物链的高级消费者--动物和人类受到危害。摄取过量Cd会引起人类的骨痛病、肾损伤、肠胃不适、心血功能障碍，甚至致癌。如日本在60年代曾发生的痛痛病，便是由于食用被Cd污染了土壤生产的“镉米”所致。^[3]近年来，我国河南等地也陆续有类似病症报道。

由于长期的环境选择和适应进化，植物发展出耐受机制，可减轻或避免 Cd² 的毒害，Cd² 胁迫下植物的耐受机制，主要包括对Cd² 的解毒和Cd² 的转运两个紧密联系的作用体系。对 Cd² 的解毒作用涉及：(1)硫代谢的相关过程；(2)氧化胁迫防卫机制；(3)对Cd² 的束缚、隔离及外排机制。对 Cd² 的转运过程可能包括：(1)根际活化吸附；(2)经质外体途径和共质体途径的短距离运输；(3)经木质部及韧皮部装载的长距离运输；(4)叶表皮毛的浓集。硫转运蛋白、硫还原相关酶类以及半胱氨酸、谷胱甘肽和植物螯合肽合成基因的表达受Cd² 调控。同时这些基因的过表达也能提高植物对Cd² 的耐性。植物抗氧化系统对Cd² 胁迫诱发的活性氧的清除作用，具转运Cd² 活性的质膜转运蛋白促进Cd² 经共质体途径向木质部运输、装载，而后随蒸腾流向地上部迁移，具转运Cd² 活性的液泡膜转运蛋白促进Cd² 进入液泡的隔离作用，这些基因都在植物对Cd² 的耐性中起作用。^[4]木本植物抗重金属或超积累种质筛选已经备受重视，也已取得了一些进展，已有的研究发现许多基因参与了金属的吸收、转运、区隔化、化学转化以及植物对金属的耐性，过表达这些基因来提高木本植物耐重金属能力是一种可行的植物修复途径。

20世纪80年代，利用绿色植物修复重金属污染的土壤和水体这一思想的提出，赋予了过去只是作为金属矿藏指示植物的重金属富集或超富集植物(hyperaccumulator)以新的生命力。通过筛选和培育特种植物，特别是对重金属等污染物具有超常规吸收和富集能力的植物，将其种植在污染的土壤上，可以把土壤中的污染物吸收起来，还可以将植物吸收的重金属元素等加以回收利用。这种方式以其廉价、清洁、生态友好等优势，受到国内外学术界和产业界的密切关注，成为了国内乃至国际上学术界研究的热点问题。^[5]利用传统的育种方法可以培育出对镉或其他重金属具有很好耐受性的植物，但进展缓慢。国内外研究者已经初步了解并筛选出一些耐重金属或重金属超积累植物。因此深入研究植物耐重金属机制，分离抗性相关基因对于培育高抗性植物，加快重金属污染土壤的植物修复具有重要意义。

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