12株猪链球菌耐药性检测

论文总字数：8069字

摘 要

近年来随着养猪业的发展，猪链球病也在世界范围内传播，严重威胁着养猪业和公共卫生的安全。本实验采用药敏纸片扩散法对12株淮安猪场分离的猪链球菌进行20种常用抗生素的耐药性实验。实验结果表明：分离的12株猪链球菌对红霉素，四环素和卡那霉素的耐药性为100%，庆大霉素为83.3%，多西环素为33.3%，青霉素为25%。对新霉素，头孢拉定，头孢唑林和头孢氨苄敏感性为100%，哌拉西林为91.7%，羧苄西林为66.7%，氨苄西林为83.3%。因此通过本次实验可以知道当该猪场发生猪链球菌病的时候可以选用头孢菌素类或青霉素类抗菌药物来治疗。

关键词: 猪链球菌，耐药性，药敏试验

Abstract: Streptococcosis suis(SS) was the serious cause of economic loss of pig industry and spread widely in the world. It also caused threaten to the public health. In this paper, we used agar diffusion method(K-B method) to analyze the drug resistance of the 12 SS strains insolated form Huaian on 20 common antibiotics. The results showed that the percentages of drug resistant strains were 100% to E, TE and K, 83.3% to CN, 33.3% to DO and 25% to P. The sensitivity of N, CE, KZ and CL were 100%, TCP were 91.7%, CAR were 66.7% and SAM were 83.3%. This result was important for clinic to prevent and treat swine streptococcicosis.

Keywords: Streptococcus suis, resistance, drug sensitivity test

1 前言

猪链球菌病是一种由多种致病性链球菌引起的导致人畜共患的急性，热性传染病^[1]。它主要会引起脑膜炎，关节炎，心内膜炎，多发性浆膜炎和败血症^[2]。近年来由于养猪业的集约化发展，不同地区种猪之间的调运日益频繁，因而导致了猪链球菌病的发病率明显上升，严重威胁养猪业的发展和人的生命安全。猪链球菌是1987年Kilpper-Balz和Schleifer 建议设立的一个新种，它属于链球菌属^[3] 。按照荚膜多糖的差异，猪链球菌可以被分成35个血清型，即1/2型(同时含有1型和2型抗原的菌株)和1 型～34型，其中可以引起人兽患病的有9型，2型，1型，7型和8型等血清型的猪链球菌，但是主要是以2型猪链球菌为主^[4]。目前，尚无理想的疫苗能够预防该病，虽然理论上应该有很多药物能够用来治疗猪链球病，但是随着抗菌药物的大量和不恰当的使用，猪链球菌对抗生素耐药现象日趋严重^[5-7]，为此本实验希望通过对猪链球菌的耐药性进行分析来为猪链球菌的治疗和防御奠定基础。

• 1. 耐药性现状

经表明猪链球菌对抗生素的耐药性不断提高。而在我们国家，抗生素的滥用更为严重，由此造成的后果也更为严重。随着抗生素在养殖行业的广泛使用，猪链球菌对四环素类，大环内酯类以及磺胺类抗生素的耐药性最为严重。2004年杨建江等^[8]测定了长春地区不同猪场的22株猪链球菌对于6种常用抗生素的耐药性，结果表明，这22株菌株对克林霉素的耐药性较高，80%以上的菌株都对环丙沙星、红霉素、和阿奇霉素耐药，但是对青霉素的敏感性比较高。倪宏波等^[9]在2001~2002年对长春地区分离出的20株猪链球菌进行了耐药性检测，结果显示，其中的5株菌株对红霉素、链霉素、四环素的耐药性都比较高。宋立等^[10]在2005年对从四川地区死猪体内分离出的2型7个猪链球菌进行耐药性实验，结果显示，7个菌株都对青霉素类、氯霉素类和头孢类高度敏感，对链霉素、多西环素、土霉素、和四环素耐药，对新霉素和庆大霉素中度敏感。以上实验结果可以看出，在我国猪链球菌的耐药性非常严重而且在不同地区会有所不同，但是基本上对头孢类，青霉素类比较敏感，对四环素类，磺胺类耐药性比较严重。

1. 材料和方法

2.1 材料和试剂

2.1.1菌株

2014-2015年间分离自淮安某猪场的12株猪链球菌。

2.1.2 试剂及培养基

M-H琼脂培养基购自英国Oxoid公司

无菌脱纤维绵羊血购自南京便诊生物科技有限公司

2.1.3 药敏纸片及抗生素

药敏纸片购自杭州微生物试剂有限公司，共20种，药物如下：红霉素，米诺环素，多西环素，四环素，新霉素，卡那霉素，庆大霉素，丁胺卡那，头孢哌酮，头孢曲松，头孢呋辛，头孢他啶，头孢唑林，头孢拉定，头孢氨苄，哌拉西林，羧苄西林，氨苄西林，苯唑西林和青霉素。

2.2 实验方法

2.2.1 培养基的配制

称取7.6g M-H 粉末溶于200mL蒸馏水中，搅拌均匀。放在高压灭菌锅中灭菌15分钟，待灭菌锅温度降到50度左右拿出三角瓶。然后在三角瓶中加入10mL的无菌脱纤维绵羊血，羊血要充分混匀，而且要在培养基凝固之前尽快倒完，倒平板的厚度在4mm左右。

2.2.2 药敏实验过程

采用纸片扩散法，将分离得到的12个菌株分别放在LB培养基中培养18至24小时，用无菌生理盐水将菌液浊度调到0.5个麦氏单位标准管，这个盐水悬浊液可直接作为接种物。用无菌棉签蘸取菌液进行接种，在接种物上方管壁处反复挤压几次，挤出过多的菌液，接种后培养皿盖半开3至5分钟。用无菌棉签在无菌干燥的加5%无纤维绵羊血的M-H琼脂培养基表面涂布接种，接种的时候应该保证菌液平均分布，同时还应该用无菌棉签涂抹在琼脂的边缘。最后将药敏纸片贴在平板表面，轻压一下纸片，确保与琼脂表面完全接触。应该均匀的贴药敏纸片，中间间距不小于24毫米，而且只要一接触琼脂表面就不能再移动位置，应该在其他地方贴新的试纸，因为有些药物会立刻扩散影响实验结果。同时贴不同的药敏纸片时使用的夹子应该在酒精灯火焰处烧一下，防止不同的抗生素之间污染。贴完药敏纸片后，最好在15分钟内将平板倒扣，放在37度恒温培养箱恒温培养24小时后，观察抑菌圈的大小，抑菌圈的最终结果为3次测定的平均值。判断猪链球菌敏感性大小指标请见表1。

表1 药敏实验判断标准

Table 1 The criteria of drug sensitivity test

药物 Drugs	纸片含量/μg Drug contents	抑菌圈直径/mm Diameter of inhibition ring
		R	I	S
红霉素 Erythromycin	15	≤15	16~20	≥21
米诺环素 Minocycline	30	≤14	15~18	≥19
多西环素 Doxycycline	30	≤12	13~15	≥16
四环素 Tetracycline	20	≤18	19~22	≥23
新霉素 Neomycin	30	≤12	13~16	≥17
卡那霉素 Kanamycin	30	≤12	13~14	≥15
庆大霉素 Gentamicin	10	≤12	13~14	≥15
丁胺卡那 Amikacin	30	≤12	13~14	≥15
头孢哌酮 Cefoperazone	75	≤15	16~20	≥21
头孢曲松 Ceftriaxone	30	≤24	25~26	≥27
头孢呋辛 Cefuroxime	30	≤14	15~22	≥23
头孢他啶 Ceftazidime	30	≤14	15~17	≥18
头孢唑林 Cefamezin	30	≤14	15~17	≥18
头孢拉定 Cefradine	30	≤14	15~17	≥18
头孢氨苄 Cefalotin	30	≤14	15~17	≥18
哌拉西林 Piperacillin	100	≤17	18~20	≥21
羧苄西林 Carbenicillin	100	≤19	20~22	≥23
氨苄西林 Ampicillin	10	≤18	19~25	≥26
苯唑西林 Oxacillin	10	≤18	19	≥20
青霉素 Penicillin	10	≤19	20~27	≥28

注：“R”为耐药；“I”为中度敏感；“S”为高度敏感

3 结果分析

对12株猪链球菌分离株药敏试验结果如下表2，表3

表2 12株分离株的药敏试验结果

药物	抑菌圈直径/mm
	菌株SY1B1		菌株SY1B2	菌株SY1B3	菌株SY1B6	菌株SY1B7	菌株 SY1B9	菌株SY1B10	菌株SY2G1	菌株SY1G1	菌株SY2G3	菌株SY2G2	菌株SY2G4
大环内酯类：
红霉素		0	0	0	0	0	8	0	0	0	0	10	0
四环素类：
米诺环素		17	22	16	22	20	23	22	22	20	18	21	14
多西环素		12	12	11	14	12	18	15	14	14	13	16	13
四环素		13	10	11	14	12	17	15	13	12	15	17	13
氨基糖苷类：
新霉素		20	21	19	22	20	22	24	26	28	21	26	26
卡那霉素		0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
庆大霉素		0	0	0	0	0	0	0	0	0	23	0	17
丁胺卡那		19	17	16	26	14	18	11	13	15	15	16	16
头孢菌素类：
头孢哌酮		29	28	23	25	21	23	19	16	21	32	20	30
头孢曲松		27	26	26	26	21	23	25	22	27	28	26	29
头孢呋辛		27	23	24	22	22	21	20	15	20	29	23	25
头孢他啶		27	16	23	26	22	19	21	13	21	13	0	12
头孢唑林		28	26	28	24	23	29	22	22	20	24	25	30
头孢拉定		29	25	28	28	24	32	27	26	25	33	24	28
头孢氨苄		18	24	28	29	21	22	25	18	23	32	25	29
青霉素类：
哌拉西林		22	24	30	25	22	20	21	21	24	30	25	26
羧苄西林		24	30	24	25	24	21	25	22	25	22	28	16
氨苄西林		28	24	29	29	26	20	29	27	27	31	29	28
苯唑西林		18	17	10	0	0	0	0	0	0	0	0	0
青霉素类		19	21	26	26	22	20	26	21	25	10	27	16

表3 12株分离株药敏实验统计

药品	敏感株	中度敏感株	耐药株	高敏率/%	耐药率/%
大环内酯类：
红霉素	0	0	12	0	100
四环素类：
米诺环素	8	3	1	66.7	8.3
多西环素	2	6	4	16.7	33.3
四环素	0	0	12	0	100
氨基糖苷类：
新霉素	12	0	0	100	0
卡那霉素	0	0	12	0	100
庆大霉素	2	0	10	16.7	83.3
丁胺卡那	9	2	1	75	8.3
头孢菌素类：
头孢哌酮	9	3	0	75	0
头孢曲松	4	5	3	33.3	25
头孢呋辛	6	6	0	50	0
头孢他啶	7	1	4	58.3	33.3
头孢唑林	12	0	0	100	0
头孢拉定	12	0	0	100	0
头孢氨苄	12	0	0	100	0
青霉素类：
哌拉西林	11	1	0	91.7	0
羧苄西林	8	3	1	66.7	8.3
氨苄西林	10	2	0	83.3	0
苯唑西林	0	0	12	0	100
青霉素	1	9	3	8.3	25

由表2，表3可知12株猪链球菌对抗生素有不同的耐药性，对新霉素，头孢唑啉，头孢拉定，头孢氨苄和哌拉西林高度敏感，高敏率分别为100%，100%，100%，100%和91.7%。对卡那霉素，红霉素，苯唑西林，四环素和庆大霉素高度耐药，耐药率分别为100%，100%，100%，100%和83.3%。而且所有的菌株都具有卡那霉素抗性，大多数的菌株都具有庆大霉素，红霉素和苯唑西林抗性。总的来说12株猪链球菌对大环内酯类抗生素，四环素类抗生素耐药性比较高，对头孢菌素类和青霉素类敏感率较高。

表4 12株菌株多重耐药性统计

多重耐药性
耐药药物/种	菌株数/株	百分比/%
5	2	16.7
6	6	50
7	3	25
8	1	8.3

由表4可以知道12株猪链球菌都有多重耐药性，其中有1株即菌株对8种药物都有抗性，另外对7种药物产生抗性的菌株有3种占总数的25%，对6种药物产生抗性的比例是50%，对5种药物产生抗性的比例为16.7%。

表5 耐青霉素菌株耐药性统计

药物	耐青霉素菌株耐药性统计
	菌株SY1B1	菌株SY2G3	菌株SY2G4
红霉素	√	√	√
米诺环素			√
多西环素	√
四环素	√	√	√
卡那霉素	√	√	√
庆大霉素	√
头孢他啶		√	√
羧苄西林			√
苯唑西林	√	√	√

注：“√”代表具有耐药性

在以前的很多实验中，结果都显示猪链球菌对青霉素的敏感。而本次实验出现了3株对青霉素耐药菌株，分别是菌株SY₁B₁，菌株SY₂G₃和菌株SY₂G₄。由表5可知这3株对青霉素耐药的菌株都对红霉素，四环素，卡那霉素和苯唑西林耐药。而且菌株SY₂G₃和菌株SY₂G₄对头孢他啶耐药，菌株SY₁B₁对多西环素和庆大霉素耐药，菌株SY₂G₄ 对米诺环素和羧苄西林耐药，可见这3株菌株的耐药性比较严重。

结论

通过对淮安猪场分离的12株猪链球菌耐药性分析，结果表明这12株猪链球菌都具有不同程度的耐药性，而且有些菌株表现为多重耐药性，可见猪链球菌耐药性问题已经比较严重。从理论上讲链球菌属于革兰氏阳性菌，应该有很多药能够用来治疗猪链球病。但是由于大量和不恰当的使用抗生素，例如在猪饲料里面添加抗生素用来促进生长和预防疾病，当猪发生疾病时不及时就医而就是自己随便给猪吃大量的抗生素，这样不仅不能治好猪的病，而且还会产生大量耐药菌株，使得疾病难以控制^[11]。猪链球菌病是人畜共患的的疾病，当猪体内存在很高的抗生素耐药性时，抗生素作用消失会导致猪链球菌病难以控制，同时也会增加社会公共卫生安全的风险。本次药敏试验的结果对于淮安地区猪链球菌的发病有一定的指导意义。试验中显示新霉素，头孢唑啉，头孢拉定，头孢氨苄和哌拉西林等药物可用于淮安地区猪场猪链球菌病的治疗。但是对于猪场的猪链球菌病应该还是采用预防为主，提倡生态养殖，杜绝抗生素滥用现象。在对细菌性疾病治疗前可以先进行药敏试验，然后选取敏感性较高的抗生素混合按疗程使用。在治疗链球菌的同时，应该也准确判断是否感染了其他疾病，以及时综合的治疗疾病。

猪链球菌病病原体广泛分布于自然界，种类复杂，而且常与其他病原体混合感染发生疾病，科导致猪链球菌病的情况日趋复杂^[12]。因此我们应该要了解猪链球菌的发展动态，做好预防工作，积极预各个环节的管理，搞好卫生和消毒，无论是规模化的养猪场，还是农村的自己养殖都要搞好卫生和消毒。同时也要管理好饲料和环境卫生。

参考文献

[1] 边秀舫. 猪链球菌的病原特性及链球菌病的诊断[J]. 养殖技术顾问, 2011(07):154.

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